高效液相色譜法測定清感利咽顆粒中綠原酸、龍膽苦苷、葛根素的含量

黃寶明 陳汀波 鮑涵 林雪穎 張軍 賴小平

清感利咽顆粒由金銀花、秦艽、葛根等多味中藥組成，具清熱解毒，疏散風(fēng)熱，生津止渴之功。用于治療風(fēng)熱型感冒，藥理研究表明其具有確切的抗流感病毒效果。方中金銀花為君藥，綠原酸是其主要有效成分之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸具有顯著的抗病原微生物、抗炎、解熱、提高免疫功能的作用[1-2]。秦艽、葛根同為臣藥，兩者的主要活性成分分別包括龍膽苦苷和葛根素。前者具有抗炎、抗病原微生物、中樞興奮及健胃利膽等藥理作用[3]，后者可解熱、擴張血管以及促進血液循環(huán)等[1,4]。本方的含量測定選用綠原酸、龍膽苦苷和葛根素作為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法同時測定三者的含量。

1 材料

1.1 藥品

清感利咽顆粒(批號：20070715、20070716、20070717)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供。

1.2 試劑

綠原酸對照品(批號110753-200413)、龍膽苦苷對照品(批號110770-200611)、葛根素對照品(批號110752-200511)，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，液相用水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3 儀器

DIONEX SUMMIT 高效液相色譜儀：四元泵、自動進樣器、二級管陣列檢測器(DAD)；KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品綠原酸、龍膽苦苷、葛根素適量，加甲醇溶解定容，制成濃度為綠原酸1.000 mg/ml，龍膽苦苷1.000 mg/ml，葛根素0.508 mg/ml的單一對照品儲備液。分別精密吸取綠原酸對照品溶液0.2 ml，龍膽苦苷對照品溶液0.4 ml，葛根素對照品溶液0.2 ml，混合于5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成對照品混合液。

2.1.2 供試品溶液 取裝量差異項下的本品適量，研細(xì)，取細(xì)粉0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇25 ml,稱定重量,超聲處理(250 W，40 kHz)30 分鐘, 放冷，再稱定重量,用60%乙醇補足減失的重量,搖勻,微孔濾膜濾過, 取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 按清感利咽顆粒的組成處方及生產(chǎn)工藝，分別制備缺金銀花陰性樣品，缺秦艽陰性樣品和缺葛根陰性樣品，照“2.1.2”項方法制得陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液(A)與0.4%冰醋酸溶液(B)梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～30分鐘時10%→16% A，30～35 分鐘時16% A；流速：1 ml/min；檢測波長分別為綠原酸327 nm，龍膽苦苷278 nm，葛根素250 nm；柱溫：25℃。綠原酸、龍膽苦苷和葛根素的理論塔板數(shù)均不低于10000。在該色譜條件下，綠原酸、龍膽苦苷、葛根素3種成分可達(dá)基線分離，其它藥材成分對測定無干擾，結(jié)果見圖1。

A 混合對照品溶液(327 nm)；B 清感利咽顆粒樣品(327nm)；C 缺金銀花陰性樣品(327 nm)；D 混合對照品溶液(278 nm)；E 清感利咽顆粒樣品(278 nm)；F 缺秦艽陰性樣品(278 nm)；G 混合對照品溶液(250 nm)；H 清感利咽顆粒樣品(250 nm)；I 缺葛根陰性樣品(250 nm) 1.綠原酸 2.龍膽苦苷 3.葛根素

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品混合溶液1、2、4、6、8、10、12 μl進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，以各對照品進樣質(zhì)量(X，μg)對峰面積(Y，mAu．sec)進行線性回歸，求得回歸方程分別為：

綠原酸Y=2331.6X-2.4136(r=1)

龍膽苦苷Y=1293.6X-2.0173(r=1)

葛根素Y=3970.7X+0.8616(r=1)

結(jié)果表明綠原酸、龍膽苦苷和葛根素分別在0.04～0.48 μg、0.08～0.96 μg、0.02～0.24 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品混合液10 μl，連續(xù)進樣6次，測得峰面積積分值。綠原酸平均峰面積為940.2038，RSD為0.36%；龍膽苦苷平均峰面積為1038.6220，RSD為0.32%；葛根素平均峰面積為810.5972，RSD為0.39%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μl，分別于0、2、4、8、12 小時進樣測定。綠原酸平均峰面積為1062.0976，RSD為1.73% ；龍膽苦苷平均峰面積為874.9224，RSD為1.47%；葛根素平均峰面積為234.0577，RSD為3.40%。表明供試品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批次樣品(20070715)粉末6份，每份約0.25 g，按“2.1.2”項下方法操作。以上述色譜條件測定含量，結(jié)果綠原酸平均含量為4.4820 mg/g，RSD為1.57%；龍膽苦苷平均含量為6.5589 mg/g，RSD為1.34%；葛根素平均含量為0.5792 mg/g，RSD為2.27%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取同一批次已知含量的清感利咽顆粒(20070715)適量，研細(xì)，取細(xì)粉約0.125 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸對照品儲備液0.55 ml、龍膽苦苷對照品儲備液0.87 ml和葛根素對照品儲備液0.15 ml，按“2.1.2”項下方法操作，重復(fù)操作6份，按上述色譜條件測定含量，計算回收率，測得綠原酸、龍膽苦苷和葛根素的平均回收率分別為98.67%、97.72%、100.82%；RSD分別為2.57%、1.31%、0.63%。

2.8 樣品測定

取裝量差異項下的本品適量，研細(xì)，取細(xì)粉0.25 g，精密稱定，按樣品制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μl供試品溶液注入液相色譜儀中，測定含量。共測定3批，結(jié)果見表1。

3 討論

供試品溶液制備條件曾考察提取方法(超聲、回流)、提取溶劑種類(30%乙醇、60%乙醇、甲醇)、提取溶劑用量(10 ml 、25 ml、50 ml) 、提取時間(15、30、45 分鐘)。結(jié)果顯示樣品細(xì)粉加25 ml 60%乙醇超聲處理30 分鐘，即可提取完全，該方法簡單、省時。

表1 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

本實驗曾采用乙腈-水、甲醇-水等系統(tǒng)的不同梯度作為流動相，綠原酸的峰形不好。故參考《中國藥典》2005版一部中金銀花藥材的綠原酸含量測定色譜條件[5]，加以改進，采用甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液與0.4%磷酸溶液梯度洗脫，分離效果好，重現(xiàn)性強，在各成分的最大吸收波長(綠原酸檢測波長為327 nm，龍膽苦苷檢測波長為278 nm，葛根素檢測波長為250 nm)下可同時測定綠原酸、龍膽苦苷、葛根素的含量，各成分均達(dá)到基線分離。由于綠原酸見光易分解，對照品溶液及供試品溶液均應(yīng)置棕色量瓶，避光操作。

[1]侯家玉. 中藥藥理學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2002,74-75.

[2]吳衛(wèi)華，康 楨，歐陽冬生，等.，綠原酸的藥理學(xué)研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006,18(4): 691-694.

[3]楊書彬，王承. 龍膽化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報，2005，33(6)：54-56.

[4]潘燕，張岫美. 葛根素藥理研究近況[J]. 食品與藥品，2005，7(12A)：10-12.