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    活性氧在δ-欖香烯誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞凋亡中的作用研究

    2010-05-22 02:35:56王茜莎楊威陶淑娟董金華潘雪刁張德志
    環(huán)球中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:香烯骨髓細(xì)胞膜電位

    王茜莎 楊威 陶淑娟 董金華 潘雪刁 張德志

    欖香烯(elemene)是從姜科植物溫莪術(shù)(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)的揮發(fā)油中經(jīng)減壓蒸餾獲得的以β-欖香烯為主,同時(shí)含少量δ-欖香烯及γ-欖香烯等成分的萜烯類化合物,屬國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物[1]。目前臨床使用的欖香烯乳劑是以β-欖香烯為主要成分。δ-欖香烯是β-欖香烯的同分異構(gòu)體,實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯能誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡[2],但對人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在董金華等[3]大量提取δ-欖香烯工藝的基礎(chǔ)上,初步進(jìn)行了δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用研究。

    1 材料

    1.1 藥品與試劑

    δ-欖香烯和β-欖香烯均由沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院提供,其含量分別為95%、96.7%;用DMSO溶成8 mmol/L臨用前儲(chǔ)備液,用時(shí)培養(yǎng)基稀釋為適當(dāng)濃度用于體外實(shí)驗(yàn)。

    3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、左旋谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)購于Sigma公司; 氯甲基二氯熒光素二乙酸酯(6-Chloromethyl-2′,7′-dichlorofluorescin diacetate, CM-H2DCF-DA)和超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium,DHE)和四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide,JC-1)購于美國Molecular Probes公司。

    1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

    人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞、人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞購于American Type Culture Collection 機(jī)構(gòu)。接種在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,在37℃,5%的 CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

    1.3 動(dòng)物

    5~6周齡SPF級昆明種小鼠,雄性,18~22 g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào):SCXK(粵)2003-0002,粵監(jiān)證字2007A006]。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞體外生長活性檢測

    采用MTT法進(jìn)行。取對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔,5%CO2,37 ℃ 培養(yǎng)過夜后,加入不同濃度的δ-欖香烯(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)100 μl/孔;同時(shí)設(shè)空白對照組(0 μmol/L δ-欖香烯),復(fù)設(shè)3孔。藥物作用0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48 小時(shí)后,棄培養(yǎng)基,向每孔分別加入20 μl的5 mg/ml的MTT存儲(chǔ)液,并于37℃孵育4小時(shí)。之后向每孔加入150 μl的DMSO,酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光值A(chǔ)。按以下公式計(jì)算抑制率(IR):IR=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度A值/對照組平均吸光度A值)× 100%,并用SPSS 11.0軟件計(jì)算δ-欖香烯的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    2.2 正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝細(xì)胞WRL-68生長抑制作用

    2.2.1 骨髓細(xì)胞的制備

    取5~6周齡小鼠3~5只,雄性,斷頸處死,無菌操作取小鼠股骨骨髓細(xì)胞,用不完全培養(yǎng)基(不含血清)的RPMI-1640培養(yǎng)液6 號(hào)針頭注射器沖出骨髓細(xì)胞,靜置數(shù)分鐘,取上層懸液,1200 r/min離心5分鐘,棄上清液;用加雙抗的不完全RPMI-1640培養(yǎng)液洗2次。采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用RPMI-1640培養(yǎng)體系調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml(或1×106個(gè)/ml)。

    2.2.2 δ-欖香烯對骨髓細(xì)胞和WRL-68細(xì)胞增殖活性的抑制作用

    取對數(shù)生長期的WRL-68細(xì)胞,以1×104個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔);正常小鼠骨髓細(xì)胞以4×105個(gè)/ml接種于加到96孔板中(100 μl/孔)。次日加入不同濃度的δ-欖香烯(0~400 μmol/L)100 μl/孔,復(fù)設(shè)3孔。藥物作用24小時(shí)后棄培養(yǎng)基,按“2.1”項(xiàng)下方法檢測并計(jì)算IR。

    2.3 線粒體膜電位的檢測

    線粒體膜電位通常采用JC-1標(biāo)記法進(jìn)行測定。線粒體是否完整是通過檢測線粒體膜電位的變化來確定的。細(xì)胞接種同上。培養(yǎng)12 小時(shí)后,加入200 μM δ-欖香烯,藥物作用0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)后,用300 nM的JC-1,37°C避光孵育15分鐘。然后用0.25%的胰酶消化收集1×106的細(xì)胞,并用冰冷的PBS洗一次,然后將收集的細(xì)胞用PBS均勻懸浮,立即用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。計(jì)數(shù)2×105個(gè)的細(xì)胞即可。

    2.4 檢測ROS的生成

    過氧化氫物和超氧化物通常采用CM-H2DCFDA(美國Molecular Probe 公司),參照文獻(xiàn)[4]稍作改進(jìn)。取對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞,接種于100 mm 培養(yǎng)皿中。200 μM 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后離心收集細(xì)胞,并用200 μl 的RPMI 1640 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。然后加入10 μM CM-H2DCFDA于37℃孵育45分鐘,最后用PBS緩沖液清洗以除去CM-H2DCFDA。用流式細(xì)胞儀通過相對于正常細(xì)胞的熒光密度來檢測ROS的含量。GSH于δ-欖香烯作用前1小時(shí)進(jìn)行預(yù)處理,考察3小時(shí)對凋亡細(xì)胞的影響。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的增殖抑制

    實(shí)驗(yàn)考察了δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞作用的時(shí)效關(guān)系,結(jié)果表明δ-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性(圖1)。δ-欖香烯分別作用DLD-1細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí),其IC50分別為308.4 μmol/L、222.4 μmol/L和159.8 μmol/L(圖1)。

    圖1 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞作用不同時(shí)間的增殖抑制作用

    3.2 δ-欖香烯對正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長抑制作用

    圖2 δ-欖香烯對正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長抑制作用

    由圖2可知,24小時(shí)時(shí)200 μmol/L 的δ-欖香烯對人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的抑制率僅在10%左右,400 μmol/L 其抑制率不到20%,提示200 μmol/L δ-欖香烯對WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞增殖的抑制作用明顯較腫瘤細(xì)胞弱。

    3.3 JC-1 檢測δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞線粒體膜電位(Δφm)的影響

    經(jīng)200 μmol/L的δ-欖香烯作用后,DLD-1細(xì)胞的Δφm出現(xiàn)下降,如圖3所示??瞻讓φ战M中,絕大部分細(xì)胞(R1區(qū))發(fā)出標(biāo)志線粒體完整的高密度紅色熒光;δ-欖香烯作用組中,R1區(qū)的細(xì)胞顯著性減少,R2區(qū)的細(xì)胞是(明亮的綠色熒光同時(shí)伴有低密度的紅色熒光)細(xì)胞——標(biāo)志著線粒體膜電位降低——隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加,即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性。與空白對照組相比,200 μmol/L 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6 小時(shí)呈現(xiàn)綠色JC-1熒光(標(biāo)志著線粒體膜電位降低),這與線粒體膜去極化降低相一致。

    圖3 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞膜電位的影響

    如圖4結(jié)果所示,Dφm的降低隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加,即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性,6小時(shí),12小時(shí),24 小時(shí)線粒體膜電位降低的發(fā)生趨勢分別是空白組的(2.24±0.12)倍、(2.85±0.33)倍、(5.11±0.24)倍(與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01)。

    圖4 δ-欖香烯不同時(shí)間對DLD-1細(xì)胞膜電位變化

    3.4 δ-欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與ROS的生成增加有關(guān)

    用流式細(xì)胞儀檢測δ-欖香烯所引起DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成(圖5)。200 μM 的δ-欖香烯處理DLD-1細(xì)胞所引起的ROS的生成呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增加。如圖5所示,200 μmol/L 的δ-欖香烯作用1小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)所引起的ROS含量的增加,分別接近空白對照組的7.8倍、18.2倍和21.8倍,此增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(*P<0.01,**P<0.001)。此外,δ-欖香烯的這種作用可以被GSH(ROS的清除劑)顯著性抑制,即加入GSH后δ-欖香烯對ROS生成率(3.46%)與空白對照(2.11%)相比無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示δ-欖香烯誘導(dǎo)的DLD-1細(xì)胞凋亡過程可能與ROS的生成增加相關(guān)。

    4 討論

    近年來,非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為國際藥品市場發(fā)展的重要趨勢。欖香烯體外對多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用已有報(bào)道[5-6]。欖香烯對人正常末梢血白細(xì)胞的IC50值為1.244 mmol/L。本研究表明δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的生長抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性,對DLD-1細(xì)胞的IC50值為222.4 mmol/L,此結(jié)果與欖香烯對DLD-1細(xì)胞的IC50值極為接近(182.4 mmol/L)[7]。研究中同時(shí)采用MTT法比較了δ-欖香烯對人正常肝胚胎細(xì)胞WRL-68和小鼠骨髓細(xì)胞的作用,研究表明δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞生長抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對正常肝細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞的作用。δ-欖香烯對正常細(xì)胞的抑制作用很弱,即提示δ-欖香烯可能是一種無細(xì)胞毒性的活性單體。

    圖5 δ-欖香烯致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS生成(橫坐標(biāo)表示相對熒光密度,縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)量)

    圖6 δ-欖香烯不同時(shí)間致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS量變化

    目前認(rèn)為,細(xì)胞內(nèi)過量的ROS蓄積可以引起線粒體膜電位下降,直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究表明,DLD-1細(xì)胞經(jīng)δ-欖香烯處理6 小時(shí)后,線粒體膜電位開始下降,是繼大量ROS 產(chǎn)生的后發(fā)事件。提示δ-欖香烯所致的線粒體膜電位下降是由于ROS蓄積而引起的。GSH 被認(rèn)為是平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[9-10]。許多不同的抗氧化劑諸如NAC[11-12]、ascorbate[13]及α-tocopherol[13]的加入則抑制凋亡的發(fā)生,這表明ROS的生成在多種細(xì)胞凋亡中擔(dān)任了極其重要的作用。進(jìn)一步研究證實(shí),很多抗腫瘤藥物在啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡過程前,細(xì)胞內(nèi)GSH 被耗竭,同時(shí)伴有活性氧的蓄積[14]。將DLD-1細(xì)胞在δ-欖香烯作用3小時(shí)前用GSH預(yù)處理,考察GSH對δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,δ-欖香烯所引起的凋亡作用可以被GSH完全抑制,其水平與空白組水平一致,即提示ROS在δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

    總之,此次實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯是一種非常有效的抗腫瘤活性單體,它能夠有效的誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的凋亡發(fā)生,其凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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