• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    活性氧在δ-欖香烯誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞凋亡中的作用研究

    2010-05-22 02:35:56王茜莎楊威陶淑娟董金華潘雪刁張德志
    環(huán)球中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:香烯骨髓細(xì)胞膜電位

    王茜莎 楊威 陶淑娟 董金華 潘雪刁 張德志

    欖香烯(elemene)是從姜科植物溫莪術(shù)(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)的揮發(fā)油中經(jīng)減壓蒸餾獲得的以β-欖香烯為主,同時(shí)含少量δ-欖香烯及γ-欖香烯等成分的萜烯類化合物,屬國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物[1]。目前臨床使用的欖香烯乳劑是以β-欖香烯為主要成分。δ-欖香烯是β-欖香烯的同分異構(gòu)體,實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯能誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡[2],但對人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在董金華等[3]大量提取δ-欖香烯工藝的基礎(chǔ)上,初步進(jìn)行了δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用研究。

    1 材料

    1.1 藥品與試劑

    δ-欖香烯和β-欖香烯均由沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院提供,其含量分別為95%、96.7%;用DMSO溶成8 mmol/L臨用前儲(chǔ)備液,用時(shí)培養(yǎng)基稀釋為適當(dāng)濃度用于體外實(shí)驗(yàn)。

    3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、左旋谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)購于Sigma公司; 氯甲基二氯熒光素二乙酸酯(6-Chloromethyl-2′,7′-dichlorofluorescin diacetate, CM-H2DCF-DA)和超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium,DHE)和四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide,JC-1)購于美國Molecular Probes公司。

    1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

    人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞、人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞購于American Type Culture Collection 機(jī)構(gòu)。接種在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,在37℃,5%的 CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

    1.3 動(dòng)物

    5~6周齡SPF級昆明種小鼠,雄性,18~22 g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào):SCXK(粵)2003-0002,粵監(jiān)證字2007A006]。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞體外生長活性檢測

    采用MTT法進(jìn)行。取對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔,5%CO2,37 ℃ 培養(yǎng)過夜后,加入不同濃度的δ-欖香烯(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)100 μl/孔;同時(shí)設(shè)空白對照組(0 μmol/L δ-欖香烯),復(fù)設(shè)3孔。藥物作用0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48 小時(shí)后,棄培養(yǎng)基,向每孔分別加入20 μl的5 mg/ml的MTT存儲(chǔ)液,并于37℃孵育4小時(shí)。之后向每孔加入150 μl的DMSO,酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光值A(chǔ)。按以下公式計(jì)算抑制率(IR):IR=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度A值/對照組平均吸光度A值)× 100%,并用SPSS 11.0軟件計(jì)算δ-欖香烯的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    2.2 正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝細(xì)胞WRL-68生長抑制作用

    2.2.1 骨髓細(xì)胞的制備

    取5~6周齡小鼠3~5只,雄性,斷頸處死,無菌操作取小鼠股骨骨髓細(xì)胞,用不完全培養(yǎng)基(不含血清)的RPMI-1640培養(yǎng)液6 號(hào)針頭注射器沖出骨髓細(xì)胞,靜置數(shù)分鐘,取上層懸液,1200 r/min離心5分鐘,棄上清液;用加雙抗的不完全RPMI-1640培養(yǎng)液洗2次。采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用RPMI-1640培養(yǎng)體系調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml(或1×106個(gè)/ml)。

    2.2.2 δ-欖香烯對骨髓細(xì)胞和WRL-68細(xì)胞增殖活性的抑制作用

    取對數(shù)生長期的WRL-68細(xì)胞,以1×104個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔);正常小鼠骨髓細(xì)胞以4×105個(gè)/ml接種于加到96孔板中(100 μl/孔)。次日加入不同濃度的δ-欖香烯(0~400 μmol/L)100 μl/孔,復(fù)設(shè)3孔。藥物作用24小時(shí)后棄培養(yǎng)基,按“2.1”項(xiàng)下方法檢測并計(jì)算IR。

    2.3 線粒體膜電位的檢測

    線粒體膜電位通常采用JC-1標(biāo)記法進(jìn)行測定。線粒體是否完整是通過檢測線粒體膜電位的變化來確定的。細(xì)胞接種同上。培養(yǎng)12 小時(shí)后,加入200 μM δ-欖香烯,藥物作用0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)后,用300 nM的JC-1,37°C避光孵育15分鐘。然后用0.25%的胰酶消化收集1×106的細(xì)胞,并用冰冷的PBS洗一次,然后將收集的細(xì)胞用PBS均勻懸浮,立即用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。計(jì)數(shù)2×105個(gè)的細(xì)胞即可。

    2.4 檢測ROS的生成

    過氧化氫物和超氧化物通常采用CM-H2DCFDA(美國Molecular Probe 公司),參照文獻(xiàn)[4]稍作改進(jìn)。取對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞,接種于100 mm 培養(yǎng)皿中。200 μM 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后離心收集細(xì)胞,并用200 μl 的RPMI 1640 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。然后加入10 μM CM-H2DCFDA于37℃孵育45分鐘,最后用PBS緩沖液清洗以除去CM-H2DCFDA。用流式細(xì)胞儀通過相對于正常細(xì)胞的熒光密度來檢測ROS的含量。GSH于δ-欖香烯作用前1小時(shí)進(jìn)行預(yù)處理,考察3小時(shí)對凋亡細(xì)胞的影響。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的增殖抑制

    實(shí)驗(yàn)考察了δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞作用的時(shí)效關(guān)系,結(jié)果表明δ-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性(圖1)。δ-欖香烯分別作用DLD-1細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí),其IC50分別為308.4 μmol/L、222.4 μmol/L和159.8 μmol/L(圖1)。

    圖1 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞作用不同時(shí)間的增殖抑制作用

    3.2 δ-欖香烯對正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長抑制作用

    圖2 δ-欖香烯對正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長抑制作用

    由圖2可知,24小時(shí)時(shí)200 μmol/L 的δ-欖香烯對人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的抑制率僅在10%左右,400 μmol/L 其抑制率不到20%,提示200 μmol/L δ-欖香烯對WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞增殖的抑制作用明顯較腫瘤細(xì)胞弱。

    3.3 JC-1 檢測δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞線粒體膜電位(Δφm)的影響

    經(jīng)200 μmol/L的δ-欖香烯作用后,DLD-1細(xì)胞的Δφm出現(xiàn)下降,如圖3所示??瞻讓φ战M中,絕大部分細(xì)胞(R1區(qū))發(fā)出標(biāo)志線粒體完整的高密度紅色熒光;δ-欖香烯作用組中,R1區(qū)的細(xì)胞顯著性減少,R2區(qū)的細(xì)胞是(明亮的綠色熒光同時(shí)伴有低密度的紅色熒光)細(xì)胞——標(biāo)志著線粒體膜電位降低——隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加,即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性。與空白對照組相比,200 μmol/L 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6 小時(shí)呈現(xiàn)綠色JC-1熒光(標(biāo)志著線粒體膜電位降低),這與線粒體膜去極化降低相一致。

    圖3 δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞膜電位的影響

    如圖4結(jié)果所示,Dφm的降低隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加,即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性,6小時(shí),12小時(shí),24 小時(shí)線粒體膜電位降低的發(fā)生趨勢分別是空白組的(2.24±0.12)倍、(2.85±0.33)倍、(5.11±0.24)倍(與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01)。

    圖4 δ-欖香烯不同時(shí)間對DLD-1細(xì)胞膜電位變化

    3.4 δ-欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與ROS的生成增加有關(guān)

    用流式細(xì)胞儀檢測δ-欖香烯所引起DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成(圖5)。200 μM 的δ-欖香烯處理DLD-1細(xì)胞所引起的ROS的生成呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增加。如圖5所示,200 μmol/L 的δ-欖香烯作用1小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)所引起的ROS含量的增加,分別接近空白對照組的7.8倍、18.2倍和21.8倍,此增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(*P<0.01,**P<0.001)。此外,δ-欖香烯的這種作用可以被GSH(ROS的清除劑)顯著性抑制,即加入GSH后δ-欖香烯對ROS生成率(3.46%)與空白對照(2.11%)相比無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示δ-欖香烯誘導(dǎo)的DLD-1細(xì)胞凋亡過程可能與ROS的生成增加相關(guān)。

    4 討論

    近年來,非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為國際藥品市場發(fā)展的重要趨勢。欖香烯體外對多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用已有報(bào)道[5-6]。欖香烯對人正常末梢血白細(xì)胞的IC50值為1.244 mmol/L。本研究表明δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞的生長抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性,對DLD-1細(xì)胞的IC50值為222.4 mmol/L,此結(jié)果與欖香烯對DLD-1細(xì)胞的IC50值極為接近(182.4 mmol/L)[7]。研究中同時(shí)采用MTT法比較了δ-欖香烯對人正常肝胚胎細(xì)胞WRL-68和小鼠骨髓細(xì)胞的作用,研究表明δ-欖香烯對DLD-1細(xì)胞生長抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對正常肝細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞的作用。δ-欖香烯對正常細(xì)胞的抑制作用很弱,即提示δ-欖香烯可能是一種無細(xì)胞毒性的活性單體。

    圖5 δ-欖香烯致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS生成(橫坐標(biāo)表示相對熒光密度,縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)量)

    圖6 δ-欖香烯不同時(shí)間致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS量變化

    目前認(rèn)為,細(xì)胞內(nèi)過量的ROS蓄積可以引起線粒體膜電位下降,直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究表明,DLD-1細(xì)胞經(jīng)δ-欖香烯處理6 小時(shí)后,線粒體膜電位開始下降,是繼大量ROS 產(chǎn)生的后發(fā)事件。提示δ-欖香烯所致的線粒體膜電位下降是由于ROS蓄積而引起的。GSH 被認(rèn)為是平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[9-10]。許多不同的抗氧化劑諸如NAC[11-12]、ascorbate[13]及α-tocopherol[13]的加入則抑制凋亡的發(fā)生,這表明ROS的生成在多種細(xì)胞凋亡中擔(dān)任了極其重要的作用。進(jìn)一步研究證實(shí),很多抗腫瘤藥物在啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡過程前,細(xì)胞內(nèi)GSH 被耗竭,同時(shí)伴有活性氧的蓄積[14]。將DLD-1細(xì)胞在δ-欖香烯作用3小時(shí)前用GSH預(yù)處理,考察GSH對δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,δ-欖香烯所引起的凋亡作用可以被GSH完全抑制,其水平與空白組水平一致,即提示ROS在δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

    總之,此次實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯是一種非常有效的抗腫瘤活性單體,它能夠有效的誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的凋亡發(fā)生,其凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

    [1]李大景,邵金良,張忠錄. 欖香烯的藥理研究及臨床應(yīng)用[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2001,12 (12):1123-1124.

    [2]Wang Xi-sha, Yang Wei, Tao Shu-juan, et al. The effect of δ-elemene on Hela Cell lines by apoptosis induction[J]. YAKUGAKU ZASSHI, 2006, 126(10): 979-990.

    [3]董金華,程寶國,胡皆漢. 溫莪術(shù)揮發(fā)油中γ-欖香烯的分離鑒定及抗腫瘤活性[J]. 中草藥,1997,28(1):13.

    [4]Curtin JF, Donovan M, Cotter TG. Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis[J]. J Immunol Methods , 2002, 265: 49-72.

    [5]胡軍,金偉,楊佩滿, β-欖香烯逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF27/ ADM細(xì)胞對阿霉素耐藥性的研究[J]. 中華腫瘤雜志,2004,26 (5):268-270.

    [6]周洪語,沈建康,侯菊生,等. 欖香烯誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 癌癥,2003,22(9): 959-963.

    [7]Wang X W. Elemene: antineoplastic[J]. rugs of The Future, 1998,23(3): 266-270.

    [8]Ricci J E, Gottlieb R A, Green D R. Caspase2 mediated loss of mitochondrial function and generation of reactive oxygen species during apoptosis [J] . J Cell Biol, 2003, 160 :65-75.

    [9]Slater A F, Steean C, Nobel I, et al. Signalling mechanisms and oxidative stress in apoptosis[J] . Toxi2 col Lett, 1995, 82-83: 149-153.

    [10]Powis G, Briehl M, Oblong J. Redox signalling and the control of cell growth and death[J]. Pharmacol Ther, 1995, 68: 149-173.

    [11]Lafon C, Mathieu C, Guerrin M A. Transforming growth factor beta 1-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and bcl-2[J]. Cell Growth Differ, 1996, 7(8): 1095-1104.

    [12]Wu Y J, Muldoon L L, Neuwelt E A. The chemoprotective agent N-acetylcysteine blocks cisplatin induced apoptosis through caspase signaling pathway[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312(2): 424-431.

    [13]Barroso MP, Gomez-Diaz C, Lopez-Lluch G. Ascorbate and -tocopherol prevent apoptosis induced by serum removal independent of Bcl-2[J]. Arch Biochem Biophys, 1997, 343: 243-248.

    [14]Macho A, Hirsch T, Marzo I, et al. Glutathione depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis[J]. J Immunol, 1997, 158: 4612-4619.

    猜你喜歡
    香烯骨髓細(xì)胞膜電位
    有關(guān)動(dòng)作電位的“4坐標(biāo)2比較”
    參芪復(fù)方對GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
    β-欖香烯對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制研究
    案例微課-翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)法在骨髓細(xì)胞形態(tài)臨床教學(xué)中的應(yīng)用
    欖香烯注射液對吉非替尼在PC-9/GR細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)影響
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:37
    β-欖香烯對人胃癌細(xì)胞SGC7901的抑制作用及部分機(jī)制
    骨髓細(xì)胞涂片會(huì)診中存在的問題及影響因素*
    急性白血病患者骨髓細(xì)胞LIMD1,VEGF-C,CTGF和Survivin的mRNA異常表達(dá)及相關(guān)性研究
    魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化
    臨床血液學(xué)檢驗(yàn)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)教學(xué)的幾點(diǎn)思考
    国产精品蜜桃在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲天堂av无毛| 日韩av免费高清视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲国产精品国产精品| 网址你懂的国产日韩在线| 黄片无遮挡物在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 午夜视频国产福利| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费观看无遮挡的男女| 欧美 日韩 精品 国产| 中文资源天堂在线| 国产 一区精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久精品性色| 午夜视频国产福利| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产欧美人成| 人妻系列 视频| 国产在线男女| 亚洲真实伦在线观看| 一级片'在线观看视频| 一本久久精品| av线在线观看网站| 亚洲电影在线观看av| 精品久久久久久电影网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产爽快片一区二区三区| 搞女人的毛片| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费大片18禁| 特大巨黑吊av在线直播| 国产一区二区三区综合在线观看 | 人妻一区二区av| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产精品999| 99久久九九国产精品国产免费| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜日本视频在线| 中国三级夫妇交换| 午夜亚洲福利在线播放| 一区二区三区免费毛片| 五月天丁香电影| 禁无遮挡网站| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲美女搞黄在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 大香蕉久久网| av国产免费在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品一区www在线观看| 免费看日本二区| 在线免费十八禁| 国产在线一区二区三区精| 色5月婷婷丁香| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲欧美精品专区久久| 国产精品福利在线免费观看| 中国三级夫妇交换| 观看美女的网站| 乱系列少妇在线播放| 99久久人妻综合| 亚洲国产精品999| 久久久亚洲精品成人影院| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 有码 亚洲区| 国产高清有码在线观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 免费观看的影片在线观看| 日本黄色片子视频| 99久久人妻综合| kizo精华| 黄色一级大片看看| h日本视频在线播放| tube8黄色片| 国产人妻一区二区三区在| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国内精品宾馆在线| 国产成人a∨麻豆精品| 水蜜桃什么品种好| 国产综合懂色| 成人亚洲欧美一区二区av| 婷婷色综合大香蕉| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 婷婷色综合大香蕉| 少妇人妻久久综合中文| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久久久久国产电影| 亚洲精品一二三| 三级经典国产精品| 成人黄色视频免费在线看| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品,欧美精品| 舔av片在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产成年人精品一区二区| 欧美zozozo另类| 91精品伊人久久大香线蕉| 老司机影院成人| 亚洲精品456在线播放app| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜福利在线在线| 成人特级av手机在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 日韩视频在线欧美| 国产男女超爽视频在线观看| av免费观看日本| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩亚洲欧美综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 看黄色毛片网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美精品专区久久| 一级a做视频免费观看| 一本久久精品| 免费黄网站久久成人精品| 人妻一区二区av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| xxx大片免费视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 深爱激情五月婷婷| 大码成人一级视频| 69av精品久久久久久| av卡一久久| 国产69精品久久久久777片| 免费少妇av软件| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品自拍成人| 国产精品三级大全| 久久久久精品性色| 久久久欧美国产精品| 亚洲最大成人中文| 日本黄大片高清| 国产精品成人在线| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲精品第二区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲在久久综合| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产成年人精品一区二区| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 九草在线视频观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 综合色av麻豆| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲在线观看片| 国产老妇女一区| 在线观看三级黄色| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲不卡免费看| 成人免费观看视频高清| 日韩欧美精品v在线| 一边亲一边摸免费视频| 下体分泌物呈黄色| 观看免费一级毛片| 人妻一区二区av| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品三级大全| 丝袜脚勾引网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美精品国产亚洲| 亚洲国产色片| 成人欧美大片| 永久免费av网站大全| 99热网站在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 成人国产av品久久久| 国产精品.久久久| 午夜福利高清视频| 国产男人的电影天堂91| 在线观看免费高清a一片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品成人av观看孕妇| 又爽又黄a免费视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 白带黄色成豆腐渣| 在线观看一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 五月天丁香电影| 亚洲av在线观看美女高潮| 男女无遮挡免费网站观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本色播在线视频| 国产成人91sexporn| 亚洲精品国产色婷婷电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 国产视频内射| 国产成人精品一,二区| 亚洲av二区三区四区| 美女国产视频在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 全区人妻精品视频| 免费观看性生交大片5| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产亚洲网站| 欧美精品一区二区大全| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久久久免| 寂寞人妻少妇视频99o| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美97在线视频| 精品久久久久久久久亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 街头女战士在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 黄色配什么色好看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩一本色道免费dvd| 性插视频无遮挡在线免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人免费观看mmmm| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品视频女| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 麻豆乱淫一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产最新在线播放| 色综合色国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线播放无遮挡| 各种免费的搞黄视频| 91精品国产九色| 国产乱人视频| 日韩亚洲欧美综合| 免费观看av网站的网址| 午夜老司机福利剧场| 少妇的逼水好多| 中国三级夫妇交换| 国产在线一区二区三区精| 街头女战士在线观看网站| 在线 av 中文字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 色5月婷婷丁香| 一边亲一边摸免费视频| 日日啪夜夜爽| 最新中文字幕久久久久| 一级av片app| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人a区在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 美女视频免费永久观看网站| 街头女战士在线观看网站| 简卡轻食公司| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 欧美三级亚洲精品| 国产在视频线精品| 免费av不卡在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| kizo精华| 搡老乐熟女国产| 国产免费又黄又爽又色| 各种免费的搞黄视频| 高清毛片免费看| 国产 一区精品| 免费黄色在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲最大成人手机在线| 欧美三级亚洲精品| 日韩免费高清中文字幕av| 九草在线视频观看| 久久综合国产亚洲精品| 人妻一区二区av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产日韩欧美在线精品| 大码成人一级视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 一级爰片在线观看| 日韩大片免费观看网站| 真实男女啪啪啪动态图| 亚州av有码| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久久久久久久亚洲| 国产亚洲一区二区精品| 2022亚洲国产成人精品| 国产视频内射| 国产精品福利在线免费观看| 欧美3d第一页| 亚洲熟女精品中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久午夜欧美精品| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 热99国产精品久久久久久7| 免费av不卡在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 伦精品一区二区三区| 嫩草影院精品99| 精品视频人人做人人爽| 亚洲欧洲日产国产| 午夜视频国产福利| 搡老乐熟女国产| 少妇的逼水好多| 国产精品三级大全| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产成人久久av| av专区在线播放| 亚洲av福利一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品一区二区免费观看| 在线观看人妻少妇| 国产精品人妻久久久影院| 国产日韩欧美亚洲二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品久久久噜噜| av又黄又爽大尺度在线免费看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 久久ye,这里只有精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲最大成人av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 在线观看国产h片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 夫妻午夜视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 内射极品少妇av片p| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 只有这里有精品99| 久久精品久久久久久久性| 午夜福利在线在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产91av在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产色爽女视频免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 深夜a级毛片| 欧美丝袜亚洲另类| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 婷婷色av中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产久久久一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产在线一区二区三区精| 美女国产视频在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 九色成人免费人妻av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 2018国产大陆天天弄谢| 18+在线观看网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲在久久综合| 国产av国产精品国产| 黄色一级大片看看| 性色avwww在线观看| 免费观看在线日韩| 国产成人aa在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲经典国产精华液单| 一级毛片我不卡| 99视频精品全部免费 在线| 插阴视频在线观看视频| av在线蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 黄片无遮挡物在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 97在线人人人人妻| 日韩大片免费观看网站| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国模一区二区三区四区视频| 三级国产精品欧美在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av不卡在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 五月玫瑰六月丁香| 免费看不卡的av| 观看美女的网站| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 在线天堂最新版资源| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲精品视频女| 欧美3d第一页| 日本wwww免费看| 观看免费一级毛片| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久久久成人| 国产免费一区二区三区四区乱码| 麻豆久久精品国产亚洲av| 人妻少妇偷人精品九色| 免费看a级黄色片| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 最近中文字幕2019免费版| 春色校园在线视频观看| 亚洲精品视频女| 国产精品伦人一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热这里只有是精品50| 久久ye,这里只有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 男男h啪啪无遮挡| 精品熟女少妇av免费看| 少妇 在线观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲久久久久久中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 可以在线观看毛片的网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产黄片美女视频| 99久国产av精品国产电影| 久久热精品热| 特大巨黑吊av在线直播| 黑人高潮一二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久6这里有精品| 国产男女超爽视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av国产精品久久久久影院| 亚洲成色77777| 久久久色成人| 亚洲欧美精品专区久久| av黄色大香蕉| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲欧美清纯卡通| 男女边摸边吃奶| 婷婷色av中文字幕| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国精品久久久久久国模美| 国产熟女欧美一区二区| 久久人人爽人人片av| 99热国产这里只有精品6| videos熟女内射| 一边亲一边摸免费视频| 日韩国内少妇激情av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲欧洲国产日韩| 成人综合一区亚洲| 日本av手机在线免费观看| 大香蕉久久网| 亚洲国产色片| av国产免费在线观看| 丝袜喷水一区| 深爱激情五月婷婷| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧洲国产日韩| 美女被艹到高潮喷水动态| 青青草视频在线视频观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 日本一本二区三区精品| 成人漫画全彩无遮挡| 一个人看的www免费观看视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| av黄色大香蕉| 激情 狠狠 欧美| 亚洲色图av天堂| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日韩制服骚丝袜av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产精品成人综合色| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产男人的电影天堂91| 日韩国内少妇激情av| 国内精品宾馆在线| 亚洲天堂av无毛| 在线观看一区二区三区激情| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 色网站视频免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久精品久久久久真实原创| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 交换朋友夫妻互换小说| 中文字幕免费在线视频6| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 五月天丁香电影| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产日韩欧美在线精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人精品久久久久久| 国产精品伦人一区二区| 亚洲av福利一区| 不卡视频在线观看欧美| 日本欧美国产在线视频| av国产免费在线观看| 联通29元200g的流量卡| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产91av在线免费观看| 国产高清国产精品国产三级 | 99热网站在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 一本久久精品| 精品人妻视频免费看| 精品久久久噜噜| av在线播放精品| 亚洲av日韩在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品久久国产蜜桃| 黄色日韩在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品一区二区在线观看99| 免费黄色在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 欧美+日韩+精品| 五月天丁香电影| 26uuu在线亚洲综合色| 99久久精品一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久久久久久久久丰满| 青春草亚洲视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 一级av片app| 一边亲一边摸免费视频| 一个人看的www免费观看视频| 秋霞在线观看毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩国内少妇激情av| 人妻少妇偷人精品九色| 精品久久久久久电影网| 91狼人影院| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av成人精品一二三区| 97超碰精品成人国产| 毛片女人毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 看黄色毛片网站| 亚洲欧美清纯卡通| 精品久久久久久久久亚洲| 午夜视频国产福利| 最近手机中文字幕大全| 精品久久久久久久久亚洲| 赤兔流量卡办理| 午夜老司机福利剧场| 亚洲天堂av无毛| 久久久精品免费免费高清| 插阴视频在线观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 久久久精品免费免费高清| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日本色播在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最近手机中文字幕大全| 看非洲黑人一级黄片| 国产在线男女| 毛片女人毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在线播放无遮挡| 在线 av 中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 另类亚洲欧美激情| 毛片女人毛片| 亚洲美女视频黄频| 尾随美女入室| 简卡轻食公司| 成人国产av品久久久| 一区二区三区免费毛片| 国产一区二区三区av在线| 人妻 亚洲 视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看|