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    虎杖及其有效成分虎杖苷對腎缺血再灌注損傷的保護作用

    2010-05-22 01:34:36李均李瑩瑩
    環(huán)球中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:虎杖預(yù)處理腎臟

    李均 李瑩瑩

    腎臟缺血再灌注損傷(renal isehemia reperfusion injury,RIRI)在臨床上十分常見,可以由外界創(chuàng)傷、腫瘤壓迫、大量失血失液、血管收縮、血栓形成等多種原因引發(fā)。腎臟是對缺血缺氧敏感的器官之一,臨床上RIRI是導致缺血性急性腎功能衰竭及腎移植失敗的主要原因。RIRI的發(fā)病機制至今仍未完全闡明,成為國內(nèi)外學者的研究熱點。既往的研究資料表明它與能量代謝障礙、大量活性氧自由基的生成、細胞內(nèi)鈣超載、細胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、內(nèi)皮素等多種因素有關(guān)。近年來越來越多的中藥被國內(nèi)外學者廣泛研究應(yīng)用于缺血再灌注的防治[1]。本實驗選用具有抗氧化作用的虎杖和其主要成分虎杖苷[2]對RIRI進行干預(yù),探討其對RIRI的保護作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料來源

    健康清潔級雄性SD大鼠72只(遵義醫(yī)學院實驗動物中心提供),體重(200±20)g?;⒄蕊嬈徸宰窳x醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院中藥房,虎杖苷粉購自西安飛達生物技術(shù)有限公司,細胞間黏附因子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)免疫組化SABC法試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 動物分組及給藥方法

    對大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為4組,假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖預(yù)處理及虎杖苷預(yù)處理組,每組18只。假手術(shù)組和缺血再灌注組大鼠實驗前1周給予生理鹽水灌胃,虎杖預(yù)處理組在實驗前1周給予濃度為0.4 g(生藥)/ml的虎杖水煎劑2.5 ml灌胃[5 g(生藥)/kg體重],虎杖苷預(yù)處理組實驗前1周給予濃度為4 mg/ml的虎杖苷細粉懸濁液2.5 ml灌胃(50 mg/kg體重)。于第7天灌胃1小時后開始手術(shù)。

    1.3 缺血再灌注模型的制備與標本取材

    假手術(shù)組僅麻醉、開腹、暴露雙腎60分鐘后縫合傷口。缺血再灌注組、虎杖預(yù)處理及虎杖苷預(yù)處理組大鼠造模。

    根據(jù)文獻制造缺血再灌注大鼠模型[3],用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉,打開腹腔,游離雙側(cè)腎血管,所有大鼠切除右腎,用無損動脈夾夾閉左腎蒂60分鐘,同時向腹腔內(nèi)注射37℃的林格氏液1 ml/100g,后松開動脈夾,若腎臟從紫黑色轉(zhuǎn)為紅色說明模型建立成功,若松開動脈夾5分鐘后未變成正常紅色,說明灌注不成功,應(yīng)棄去,造模成功后縫合傷口,自由進食、飲水。

    各組分別于缺血前10分鐘、再灌注6小時、再灌注12小時3個時間點采集腎臟及血清標本,每組每個時間點6只。

    1.4 觀察指標

    免疫組織化學染色SABC法測腎組織ICAM-1,嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

    ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α的含量,嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠腎組織ICAM-1的表達情況

    ICAM-1在造模大鼠的腎小管和腎間質(zhì)上表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積,各組的ICAM-1有不同程度的表達。ICAM-1在假手術(shù)組中幾乎無表達。半定量分析顯示,術(shù)前10分鐘時假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組大鼠腎組織ICAM-1的表達無明顯差別。再灌注6小時、12小時時,缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理腎組織中ICAM-1表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。缺血再灌注組各時間點間比較差異有顯著性(P<0.05)。再灌注6小時、12小時時虎杖及虎杖苷預(yù)處理組腎組織中ICAM-1表達明顯低于缺血再灌注組(P<0.05),虎杖與虎杖苷與處理組無明顯差別(P>0.05)。見圖1、表1。說明腎臟缺血再灌注后虎杖及虎杖苷均能通過減少腎組織ICAM-1的表達對腎臟起到保護作用。

    2.2 各組大鼠血清中TNF-α含量比較

    術(shù)前10分鐘時,假手術(shù)組、缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組大鼠血清中TNF-α含量無明顯差別。于再灌注6小時、12小時時,缺血再灌注組、虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),缺血再灌注組各時間點間比較差異有顯著性(P<0.05)。再灌注6小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量明顯低于缺血再灌注組(P<0.05),再灌注12小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組血清中TNF-α含量與缺血再灌注組無明顯差異(P>0.05),見表2。說明再灌注時間延長,血清中TNF-α含量明顯增加,腎組織損傷加重,虎杖及虎杖苷預(yù)處理組再灌注6小時時均以減少血清中TNF-α含量而減輕腎臟缺血再灌注損傷作用,于再灌注12小時則均無明顯效果。

    A 假手術(shù)組;B 術(shù)前10min組;C 缺血再灌注6h組;D 缺血再灌注12h組;E 虎杖6h組;F 虎杖12h組;G 虎杖苷6h組;H 虎杖苷12h組

    組別術(shù)前10min6h12h假手術(shù)組(n=18)103.43±3.23(n=6)102.56±2.24(n=6)102.34±2.4(n=6)缺血再灌注組(n=18)101.35±4.72(n=6)80.26±3.53ac(n=6)73.23±3.87ace(n=6)虎杖組(n=18)101.56±3.54(n=6)90.11±2.56abc(n=6)86.29±4.75abc(n=6)虎杖苷組(n=18)104.41±1.47(n=6)87.35±5.86abcd(n=6)88.23±6.12abcd(n=6)

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與缺血再灌注組比較bP<0.05;與術(shù)前比較,cP<0.05;與虎杖組比較,dP>0.05;與6小時比較,eP<0.05

    表2 各組大鼠血清TNF-α含量的比較

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與缺血再灌注組比較,bP<0.05; 與術(shù)前比較,cP<0.05;與6小時組比較,dP<0.05

    3 討論

    ICAM-1即CD54是最早發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族黏附分子之一,是細胞表面的糖蛋白,是內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)的一部分。ICAM-1通常在正常的腎小球系膜細胞、腎血管、腎小管低表達或無表達。劉百成等[4]研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后早期ICAM-1表達以內(nèi)皮細胞為主,后期腎臟各部均可表達,腎小管小管上皮尤甚,其表達量與腎功能惡化程度呈正相關(guān),提示ICAM-1在腎缺血再灌注損傷發(fā)病機制中起促進作用。TNF -α主要是由單核細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子,是炎癥反應(yīng)中重要的參與物,主要通過增強中性粒細胞活性,使活性氧,血小板活化因子等產(chǎn)生增多,引起炎癥損傷,同時促進多種炎性細胞因子的釋放,引起炎癥瀑布式放大效應(yīng)。在RIRI中,TNF-α表達增加。有實驗報道,在RIRI動物模型中應(yīng)用抗TNF-α抗體可對腎臟結(jié)構(gòu)及功能起到有效的保護作用[5]。

    本研究的結(jié)果顯示:腎缺血再灌注后ICAM-1在各組大鼠的腎小管上皮細胞有不同程度的表達,尤其在模型組,在假手術(shù)組中幾乎無表達。說明大量的ICAM-1增強了中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附,從而促進中性粒細胞的激活、外滲與浸潤,加劇腎損傷,且腎損傷隨著再灌注時間的延長而加劇?;⒄燃盎⒄溶战M中ICAM-1表達與缺血再灌注組比較明顯降低。再灌注6小時后虎杖及虎杖苷預(yù)處理組均可減少大鼠血清中TNF-α含量而減輕腎臟缺血再灌注損傷作用,但再灌注12小時后則均無明顯效果,其原因可能由于隨著再灌注時間的的延長更多的炎性因子釋放,這些炎性因子誘導炎性瀑布,放大炎性反應(yīng),而導致藥物的血藥濃度不夠,而使其對再灌注12小時后TNF-α含量無明顯影響。表明虎杖及虎杖苷均可能在腎缺血再灌注損傷中可通過減少ICAM-1的表達和再灌注后TNF-α含量而起到腎臟保護作用。

    [1]李均, 胡紹進. 中藥防治腎缺血再灌注損傷的研究進展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2009, 2(3): 223-225.

    [2]郭勝藍,孫莉莎,歐陽石,等. 虎杖苷對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2005,16(5):414-416.

    [3]Mark L.A.,Robinson A.V.,Schulak J.A..Inhibition of nitric oxide synthase reduces renal ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Surgical Research, 2005, 129(2): 236-241.

    [4]劉百成,劉耀榮. 大鼠腎缺血再灌注損傷中ICAM-1表達的變化[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2006, 7(8): 419-421.

    [5]韓述嶺,于立新,馬俊杰,等. 抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體減輕腎臟缺血再灌注損傷的實驗研究[J].第一軍醫(yī)大學學報.2003,23(4): 332-334.

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