HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芩中5種黃酮類成分的含量Δ

闞紅玉，宋殿榮，王躍飛，潘桂湘，戚愛棣（教育部方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市 300193）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根[1]，性寒，味苦，具有清熱燥濕、除火解毒、止血安胎的作用。目前，市場(chǎng)流通的商品黃芩除來自野生的和栽培的黃芩之外，有些地方還將根斷面為黃色的黃芩屬（Scutellaria）的多種植物作黃芩藥用，如粘毛黃芩（S.viscidula Bge.）、滇黃芩（S.amoena C.H.Wright）、甘肅黃芩（S.rehderiana Diels）等[2]。

黃芩中有效成分主要是黃酮類化合物。近年研究發(fā)現(xiàn)，除黃芩苷外，其它黃酮類化合物如黃芩素、漢黃芩苷以及漢黃芩素等同樣具有重要的藥理活性。其中，黃芩素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用；漢黃芩苷具有抗菌、抗病毒、凝血等作用；漢黃芩素具有抗炎、解熱的作用；此外，黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素對(duì)紫外線照射產(chǎn)生的氧化作用有明顯的抑制作用，而黃芩及其有效成分解熱、保肝和防輻射、抑制凝血酶引起的血小板凝聚等作用也有很多報(bào)道[3～5]。

2005年版《中國藥典》在黃芩藥材項(xiàng)下，僅對(duì)黃芩苷單一成分進(jìn)行質(zhì)控。鑒于此，本試驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 5種黃酮類有效成分含量的方法，并分析天津市15家零售藥店的黃芩藥材中黃酮類有效成分的差異，為綜合評(píng)價(jià)黃芩藥材的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元溶劑泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器及軟件（美國Agilent公司）；AX205型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BP121S型萬分之一天平（德國Satorius公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

黃芩苷（批號(hào)：110715-200212）、黃芩素（批號(hào)：111595-200604）、漢黃芩素（批號(hào)：1514-200202）對(duì)照品購于中國藥品生物制品檢定所；漢黃芩苷（批號(hào)：061012，純度≥99%）、千層紙素A（批號(hào)：060530，純度≥99%）標(biāo)準(zhǔn)品購于上海友思生物科技公司；黃芩飲片購自天津市內(nèi)6區(qū)15家零售藥店，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李天祥副教授鑒定均為唇形科植物黃芩S.baicalensis Georgi.的干燥根；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，22%～25%B；10～20 min，25%～40%B；20～22 min，40%～45%B；22～27 min，45%B；27～28 min，45%～60%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，分別取對(duì)照品混合溶液及供試品溶液進(jìn)樣。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A與其它組分均能達(dá)到基線分離，保留時(shí)間分別為10.03、16.27、20.93、26.54、27.82 min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素；5.千層紙素AFig 1 HPLC ChromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；1.baicalin；2.wogonoside；3.baicalein；4.wogonin；5.oroxylinA

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）黃芩苷16.04 mg、漢黃芩苷5.17 mg、黃芩素7.38 mg、漢黃芩素4.58 mg、千層紙素A 1.32 mg，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品貯備液，4℃冷藏，備用。分別精密移取各成分對(duì)照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，即得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A濃度分別為272.7、67.21、118.1、50.38、18.48 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取黃芩藥材粉末（過80目篩）0.2 g，置于25 mL容量瓶中，加入70%甲醇至2/3刻度處，超聲提取10 min，冷卻至室溫后定容，搖勻，靜置，取上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中，70%甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀。

2.4 線性關(guān)系考察

精密移取混合對(duì)照品溶液適量，分別制備含黃芩苷濃度為8.52、17.0、34.1、68.2、136.3、272.7 μg·mL-1，漢黃芩苷濃度為2.10、4.20、8.40、16.8、33.6、67.2 μg·mL-1，黃芩素濃度為3.69、7.38、14.8、29.5、59.0、118.1 μg·mL-1，漢黃芩素濃度為 1.57、3.15、6.30、12.6、25.2、50.4 μg·mL-1，千層紙素A濃度為0.58、1.16、2.31、4.62、9.24、18.5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，搖勻。吸取上述混合對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得5種成分的回歸方程。結(jié)果表明各成分在相應(yīng)進(jìn)樣量范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab 1 Linear relation of peak area and concentration（n＝6）

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A峰面積的RSD分別為0.25%、0.26%、0.20%、0.24%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 h，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 12 h內(nèi)峰面積的RSD分別為0.44%、0.58%、0.43%、0.66%、1.22%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一藥材粉末6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A的平均含量分別為67.19、9.584、25.29、6.204、2.696 mg·g-1，RSD 分別為 2.19%、2.26%、2.75%、2.01%、1.69%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取天津市15家零售藥店黃芩樣品粉末各0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗(yàn)以黃芩藥材的多組分分離為目的，盡可能在同一色譜條件下分離黃芩中多個(gè)成分，故對(duì)流動(dòng)相溶劑系統(tǒng)及柱溫進(jìn)行了考察。由于甲醇-水系統(tǒng)的分析時(shí)間長(zhǎng)于乙腈-水系統(tǒng)，且分離效果稍差，故采用乙腈-水系統(tǒng)，并加入少量甲酸改善峰形，即A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。柱溫在15、20℃時(shí)分離效果無明顯差別，30℃時(shí)分離效果差，故最終確定柱溫為20℃。

表3 天津市內(nèi)6區(qū)15家零售藥店黃芩飲片含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Results of content determination of S.baicalensis decoction from 15 retail drug stores of six districts in Tianjin

2005年版《中國藥典》規(guī)定，黃芩藥材含黃芩苷不得少于9.0%。本試驗(yàn)選擇的15家零售藥店中，若以黃芩苷來評(píng)價(jià)黃芩藥材優(yōu)劣（表3以此高低排序），其中僅有9家藥店出售的黃芩中黃芩苷含量高于9.0%，不合格率高達(dá)40%；且黃芩苷的含量最高11.03%，最低2.63%，相差近5倍，表明天津市內(nèi)零售黃芩藥材質(zhì)量參差不齊，且相差較大。藥材質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系藥效的好壞，故應(yīng)引起臨床用藥部門的重視。

若采用單一成分含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，如河西A藥店和河北B藥店，以黃芩苷計(jì)屬不合格藥材，但其黃芩素含量則為最高和次高；黃芩苷含量最高的紅橋A藥店，另4種成分含量卻非相應(yīng)最高。這說明僅以單一成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)存在一定的局限性，也說明了本試驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定黃芩藥材中5種黃酮類有效成分含量方法的必要性。

本試驗(yàn)首次采用HPLC-梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定黃芩藥材中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A 5種黃酮類有效成分的含量，并分析了天津市內(nèi)6區(qū)15家零售藥店黃芩藥材有效成分的差異，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可為黃芩藥材的質(zhì)量控制及安全、合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：231.

[2]肖麗和，王紅燕，李發(fā)美，等.不同來源黃芩藥材HPLC指紋圖譜比較[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（1）：28.

[3]孫嬌月，孫維亮.黃芩黃酮對(duì)腦線粒體損傷的保護(hù)作用[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2004，19（3）：101.

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[5]王新華，何紅梅，張延霞，等.黃芩苷對(duì)異煙肼和利福霉素鈉肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究[J].中國藥房，2007，18（28）：2175.