葛根素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

柴欣樓 王 偉 王綠婭 張永生

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市朝陽(yáng)區(qū)北三環(huán)東路 11號(hào)，100029;2北京市安貞醫(yī)院)

冠脈形成術(shù)造成了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，加速了血栓的形成。附壁血栓的形成，不僅造成血管的急性閉塞，而且為平滑肌細(xì)胞 (vessel smooth musle cell，VSMC)的內(nèi)遷提供了框架，增殖的 VSMC由血管中層向內(nèi)膜的遷移是內(nèi)膜增厚的一個(gè)重要機(jī)制。在此過(guò)程中，細(xì)胞邊緣存在大量基質(zhì)金屬蛋白酶(maxtrix metalloproteinases，MMPs)和纖維蛋白溶解酶，這 2種物質(zhì)可降解細(xì)胞外基質(zhì)，加速 VSMC的遷移[1]。VSMC遷移的結(jié)果可導(dǎo)致內(nèi)膜中 VSMC的大量積聚和結(jié)締組織的形成，進(jìn)而促進(jìn)新生內(nèi)膜形成。

葛根素(Pur)為異黃酮類(lèi)化合物，屬于植物雌激素?，F(xiàn)代藥理研究證明 Pur在心血管中具有多種功能，可擴(kuò)張心、腦血管，降低血黏度，抑制血小板活性，降低血小板黏附率;可對(duì)抗 H2O2引起的無(wú)血清培養(yǎng)的 VSMC凋亡及壞死[2]。

本研究以葛根素為研究對(duì)象，構(gòu)建 VSMC遷移模型，Boyden小室法檢測(cè) VSMC的遷移，ELISA法檢測(cè)MMP-2、MMP-9的含量，在此基礎(chǔ)上采用明膠—聚丙烯酰胺電泳酶譜分析 VSMC分泌 MMP-2的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 1)主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品)，胎牛血清 (FBS，Hyclone公司產(chǎn)品)，凝血酶(凍干粉，美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品)，葛根素原粉(純度 99.7%，由衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所提供)，MTT、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶和 EDTA、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物制品有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó) Bio-Rad公司)，MMP-2、MMP-9 ELISA試劑盒(鼎國(guó)試劑公司)。2)VSMC體外培養(yǎng)及鑒定:常規(guī)組織貼塊法培養(yǎng)VSMC。實(shí)驗(yàn)用 4～8代細(xì)胞。用光鏡和免疫組化方法進(jìn)行鑒定。3)藥物配制及梯度稀釋。4)葛根素原粉，選擇二甲基亞砜為溶劑，配制濃度分別為 10mM和1mM。將 1mM藥物溶液用溶劑以 1:10的比例進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)棺罱K藥物濃度從 1mM變化到 1nM。5)分組。正常對(duì)照組:用含 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。模型組:加終濃度為 5u/L凝血酶的 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。葛根素組:加終濃度為5u/L凝血酶和濃度為 10-2mol?L-1的葛根素溶液的1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。雷帕霉素組:加終濃度為 5u/L凝血酶和濃度為 10-4mol?L-1的雷帕霉素溶液的 1%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng):1)空氣栓塞法處死新西蘭大耳白兔，無(wú)菌條件下分離全段胸主動(dòng)脈，立即置于含青霉素 100u/mL，鏈霉素 100mg/mL的無(wú)菌生理鹽水中。2)超凈工作臺(tái)上，用含青霉素、鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗，去除脂滴、血凝塊等雜質(zhì)及可能殘留的內(nèi)皮細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞，然后將一次取材的 2～3條血管中膜組織混合在一起，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。3)滴加少許培養(yǎng)液使組織保持濕潤(rùn)，用眼科彎剪反復(fù)剪切成 1mm×1mm大小的組織塊。剪切好的組織小塊均勻置于瓶底，組織塊間距 0.5cm。蓋好瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶?jī)?nèi)注入含20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，于 37℃孵箱內(nèi)放置。4)經(jīng) 2～4h孵育后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng) 3～5d。待有細(xì)胞從組織塊周?chē)纬龊髶Q液。5)當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成“峰”“谷”交錯(cuò)的致密細(xì)胞層，即可進(jìn)行傳代。

1.3 Boyden小室法檢測(cè) VSMC的遷移

1.3.1 VSMC細(xì)胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.3.2 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞密度 1×106個(gè)/L左右細(xì)胞懸液，使細(xì)胞在培養(yǎng)液中懸浮 1h恢復(fù)形態(tài)?；靹蚣?xì)胞懸液，吸取 0.35mL加入Boyden小室的上室內(nèi)。

1.3.3 下室加入 2%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液作為正常對(duì)照組，其余加入待測(cè)藥品等，封閉下室小孔，置37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng) 6h。

1.3.4 取出 Boyden小室內(nèi)的微孔濾膜，PBS洗 2次，冷丙酮固定 10s，PBS洗 2次。

1.3.5 以蘇木素染色 5min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇脫色 3min，流水沖洗，1%NaHCO3顯藍(lán)染色 3min。

1.3.6 水洗后，37℃過(guò)夜，系列梯度乙醇脫水:70%-75%-80%-90%-100%各 0.5min。

1.3.7 二甲苯透明。

1.3.8 以中性樹(shù)膠封片。設(shè) 5個(gè)重復(fù)孔。

1.3.9 在顯微鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù) 10高倍視野下移出濾膜的 VSMC數(shù)，每張膜觀察 2遍，計(jì)算其平均數(shù)。5份濾膜內(nèi)的移動(dòng)細(xì)胞平均數(shù)表示 VSMC的遷移數(shù)量。

1.4 ELISA法檢測(cè) MMP-2、MMP-9的含量

1.4.1 VSMC細(xì)胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.4.2 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞密度 1×106個(gè)/L左右細(xì)胞懸液，6孔培養(yǎng)板，加入細(xì)胞懸液 1000μL繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，去培養(yǎng)液。

1.4.3 加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h后，棄上清。加入待測(cè)藥品等，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。

1.4.4 將上述細(xì)胞收集，低速離心，保留上清。加入96孔培養(yǎng)板，100μL/孔，設(shè) 5個(gè)重復(fù)孔。

1.4.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(490nm)。

1.5 明膠—聚丙烯酰胺電泳酶譜分析 VSMC分泌MMP-2的活性

VSMC細(xì)胞，0.125%胰酶消化后離心 1000r/min×5min，PBS液洗滌 2次，離心，棄上清。

1.5.1 用含 10%CFBS的 DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞密度 1×106個(gè)/L左右細(xì)胞懸液，6孔培養(yǎng)板，加入細(xì)胞懸液 1000μL繼續(xù)培養(yǎng) 48h后，去培養(yǎng)液。

1.5.2 加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h后，棄上清。加入待測(cè)藥品等，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。

1.5.3 將上述細(xì)胞收集，低速離心，保留上清。

1.5.4 Bradford法測(cè)培養(yǎng)液蛋白濃度，牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.5 按常規(guī)方法灌制 10%分離膠和 5%濃縮膠，但分離膠中含 0.1%明膠作為底物。取 10μL上清液樣本與等體積的上樣緩沖液混合，室溫放置 30min，上樣，電流 15mA電泳約 90min，溴酚藍(lán)到達(dá)兩層膠的分界處，將電流調(diào)至 20A，電泳 90min后溴酚藍(lán)到達(dá)底線，停止電泳。

1.5.6 小心將膠剝離，經(jīng) 2.5%TritonX-100漂洗1h，加入反應(yīng)緩沖液(50mmol/L Tris-HCL，10mmol/L CaCl2，20mmol/LNaCl)37℃過(guò)夜。

1.5.7 次日，0.5%考馬斯亮蘭染色 4h，脫色至藍(lán)色背景下白色條帶清晰可見(jiàn)。將凝膠掃描成像。

實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，以空白對(duì)照的條帶的灰度值為 1，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與空白對(duì)照相比取值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)由 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以 ˉx±s表示，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 VSMC細(xì)胞的鑒定結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及生長(zhǎng)規(guī)律。VSMC呈長(zhǎng)梭形、三角形或星形等。細(xì)胞突起較長(zhǎng)，相互接觸，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞呈典型“峰與谷”樣生長(zhǎng)。核較大，原形或卵原形，胞漿豐富。密度大時(shí)可重疊生長(zhǎng)。

2.2 葛根素對(duì) VSMC的遷移的影響(ˉx±s，n=6)葛根素組與模型組相比，P＜0.01。

2.3 葛根素對(duì) VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量的影響 (ˉx±s，n=6) VSMC分泌的 MMP-2、MMP-9含量。葛根素高濃度組與模型組相比，P＜0.01;葛根素低濃度組與模型組相比，P＜0.05。

2.4 葛根素對(duì) VSMC分泌的 MMP-2活性的影響實(shí)驗(yàn)原理:實(shí)驗(yàn)以明膠為底物，明膠被考馬斯亮藍(lán)染為藍(lán)色背景，若樣本中含有可以分解明膠的 MMP-2則在相應(yīng)分子量處可出現(xiàn)底物被水解的透明條帶，且根據(jù)條帶的灰度值可以反映酶活性的大小。若以不同的膠原或酪蛋白為底物，可以測(cè)出不同種類(lèi) MMPs的活性。

表1 VSMC分泌的 MMP-2灰度值

3 討論

早期血管彈性回縮，晚期血管重塑和新內(nèi)膜增生是直接導(dǎo)致 PTCA術(shù)后再狹窄的三個(gè)主要原因[3]。植入支架雖可擴(kuò)大管徑，防止彈性回縮發(fā)生，但支架本身對(duì)新生內(nèi)膜的形成無(wú)任何抑制作用，而且它作為異物停留在體內(nèi)可能導(dǎo)致血栓形成并刺激 VSMC增生和新生內(nèi)膜肥厚，最終導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生[4]。

VSMC是血管壁的主要細(xì)胞成分之一，是決定血管順應(yīng)性和血管重構(gòu)的重要因素，血管壁增厚和順應(yīng)性下降主要源于 VSMC的肥大、增生，產(chǎn)生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)增加等[5]。內(nèi)膜損傷后內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)和生長(zhǎng)因子與 VSMC膜受體結(jié)合后使癌基因激活、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)異常，VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，從細(xì)胞周期 G0期脫逸出并進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，發(fā)生分裂增殖并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)[6]。因此，在新生內(nèi)膜形成過(guò)程中，VSMC移行、增殖和分泌是血管內(nèi)膜增生的三個(gè)重要步驟[7]。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)主要包括膠原、糖蛋白、葡萄糖氨基糖苷和蛋白聚糖四類(lèi)。在正常組織，這些大分子存在于內(nèi)膜、中膜、外膜，起保持血管彈性和完整性的作用。研究表明成熟的 VSMC沒(méi)有遷移的特性，而且當(dāng)其處于 S或 G2/M期時(shí)不能遷移，而只有在 G1向 G1/S轉(zhuǎn)化過(guò)程中才可能遷移[8-9]。中膜 VSMC的遷移除與細(xì)胞本身有關(guān)外，還須突破細(xì)胞周?chē)倪w移屏障即成分復(fù)雜的 ECM，因此在損傷早期 ECM降解，對(duì)促進(jìn) VSMC遷移有重要作用，晚期ECM沉積對(duì)血管重塑起重要作用。MMPs主要降解ECM[10]，在正常的血管中內(nèi)皮細(xì)胞和 VSMC經(jīng)常產(chǎn)生MMP-2，TIMP-1和 TIMP-2，成為血管組織細(xì)胞更新必不可少的條件。根據(jù)降解的對(duì)象不同，將 MMPs分為 4類(lèi):MMP-1(膠原酶)、MMP-2(明膠酶 A)、MMP-3(基質(zhì)裂解素 1)、MMP-9(明膠酶 B)、MMP-12(金屬蛋白彈性酶)，膜型金屬蛋白酶。當(dāng)白介素1、腫瘤壞死因子、γ干擾素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白Ⅰ等炎癥細(xì)胞因子濃度升高時(shí)，促進(jìn) VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞和泡沫細(xì)胞表達(dá) MMPs。這可降解 ECM，促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到內(nèi)皮下;促進(jìn) VSMC由中膜遷移到內(nèi)膜。故研究細(xì)胞外基質(zhì)的降解，對(duì)于 VSMC的遷移有重要意義[11]。本實(shí)驗(yàn)建立了細(xì)胞遷移模型，并在此基礎(chǔ)上觀察了 MMP-2和 MMP-9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素可抑制 VSMC的遷移，同時(shí)，抑制 MMP-2、MMP-9，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)觀察了葛根素對(duì) VSMC分泌的 MMP-2活性的影響，發(fā)現(xiàn)葛根素組與模型組相比可顯著抑制 MMP-2的表達(dá)(P＜0.05)。關(guān)于葛根素抑制 VSMC遷移，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究可以發(fā)現(xiàn)，葛根素抑制了 VSMC的增殖，使處于G1期的細(xì)胞較多，增加了其遷移到內(nèi)膜下組織的機(jī)會(huì)，因而抑制其遷移過(guò)程變得尤為重要。但細(xì)胞遷移受多種因素影響，不僅僅與 MMP-2、MMP-9有關(guān)。這也成為今后研究關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。

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