經(jīng)皮穴位電刺激對跑臺運(yùn)動大鼠血漿氨基酸及中縫背核細(xì)胞外液5-HT含量的影響

方劍喬 梁宜 汪存信 邵曉梅 馬桂芝 李海燕

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）

經(jīng)皮穴位電刺激（transcutanous electrical acupoint timulation，TEAS）是一種新型的針灸療法，集諸多優(yōu)勢于一體［1］。以往多項(xiàng)研究表明TEAS具有良好的抗運(yùn)動性疲勞效應(yīng)［1-3］，然而關(guān)于其抗運(yùn)動性疲勞的機(jī)理研究目前主要集中于外周機(jī)制研究，對深層次的中樞機(jī)制研究不多。

5-羥色胺（serotonin，5-HT）是導(dǎo)致運(yùn)動性中樞疲勞的關(guān)鍵遞質(zhì)。色氨酸（tryptophan，TRP）是腦內(nèi)5-HT合成的前體物質(zhì)，但只有游離色氨酸（free tryptophan，f-TRP）才能與血漿支鏈氨基酸（branched-chain amino acids，BCAA）競爭載體穿越血腦屏障，腦內(nèi)5-HT含量取決于血漿f-TRP/BCAA比值高低［4］。中縫背核（dorsal raphe nucleus，DRN）是中縫核群主要成員之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺能神經(jīng)元胞體最多的核團(tuán)之一。Hong［5］和Min［6］等研究發(fā)現(xiàn)跑臺運(yùn)動使疲勞大鼠DRN內(nèi) 5-HT陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。事實(shí)上，陽性細(xì)胞和腦勻漿僅反映細(xì)胞內(nèi)5-HT含量變化，而不能正確反映細(xì)胞外（突觸間隙）5-HT含量變化。故本實(shí)驗(yàn)觀察了運(yùn)動大鼠血漿f-TRP水平、TRP游離度和f-TRP/BCAA比值的變化；并結(jié)合在體微透析采樣技術(shù)，觀察運(yùn)動大鼠DRN細(xì)胞外液5-HT水平動態(tài)變化以及TEAS對其的干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

清潔級SD（Sprangue-Dawley）大鼠20只，雄性，體重300±10g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

微透析采樣系統(tǒng)（日本Eicom公司），高效液相色譜儀（美國Agilent公司），電化學(xué)檢測器（美國ESA公司），PURELAB UHQ超純水機(jī)（美國ELGA公司），LH202H韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司），SLY-RTML六通道動物跑臺（北京碩林苑科技有限公司），大鼠腦立體定位儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）。微透析探針（膜長 2mm；OD：0.5mm；Cutoff：18KD）由浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院張恒義教授提供。

L-色氨酸（L-TRP）、L-纈氨酸（L-VAL）、L-異亮氨酸（L-ILE）、L-亮氨酸（L-LEU）、2，4-二硝基氯苯（CDNB）、5-羥色胺硫酸肌酐鹽（5-HT）、1-辛烷磺酸鈉、三乙胺TEA）、四乙酸乙二胺（EDTA）均購自Sigma公司；NaH2PO4·H2O購自MERCK公司。

1.3 立體定位手術(shù)與微透析

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，參照大鼠腦定位圖譜［7］，行DRN立體定位手術(shù)：大鼠未禁食，用2%戊巴比妥鈉溶液（60mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉；調(diào)節(jié)大鼠腦立體定位儀門齒鉤刻度低于水平面3.3mm；通過兩側(cè)耳棒和門齒鉤固定大鼠頭部，剪開頭皮剝離骨膜，充分暴露顱骨前囟以及人字縫。DRN外導(dǎo)管定位坐標(biāo)：AP：-7.8mm（from Bregma）、ML：+3.0mm（from midline）、DV：+5.8mm（from dura，30°），并用螺絲釘和牙科水泥固定。術(shù)后大鼠分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，修復(fù)7天。其中2只大鼠蘇醒后出現(xiàn)顱內(nèi)大出血死亡。

術(shù)后第7天，將微透析探針植入腦內(nèi)，用過濾脫氣的1×Ringer’s 液（147mM NaCl、4mM KCl、2.3mM CaCl2、1.0mM MgCl2）以 1μl/min的流速進(jìn)行灌流，平衡2h后，開始收集基礎(chǔ)透析液3管，每管間隔30min，每個采集管中均加入5μl 0.1M醋酸以防止神經(jīng)遞質(zhì)的降解。微透析液置－80℃保存。微透析探針體外回收率低于8%的探針，則棄用。

1.4 造模、分組與治療

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為運(yùn)動組和TEAS組，所有大鼠于術(shù)后第2d后，進(jìn)行連續(xù)3d適應(yīng)性跑臺運(yùn)動：以10m/min的速度運(yùn)動15min，1次/d。TEAS組大鼠術(shù)后第2d開始接受TEAS治療：取穴為右側(cè)足三里，與同側(cè)小腿下1/3處前外側(cè)緣非穴位，治療參數(shù)為2Hz、5mA、30min，1次/d，共6次（最后1次治療在跑臺運(yùn)動后即刻，與微透析采樣同步進(jìn)行）。運(yùn)動組則給予與TEAS組大鼠相同的固定、跑臺運(yùn)動及微透析采樣處理。

于術(shù)后第7d進(jìn)行微透析采樣和急性跑臺運(yùn)動。采集完基礎(chǔ)透析液后，將大鼠與自由活動裝置分離（探針仍保留）后，實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行急性跑臺運(yùn)動：先以10m/min的速度運(yùn)動10min，在隨后4min內(nèi)將跑速調(diào)至24m/min并持續(xù)運(yùn)動1h，坡度為0，其間給予毛刷刺激以確保大鼠持續(xù)運(yùn)動。運(yùn)動結(jié)束將大鼠重新與自由活動裝置連接，并采集微透析液直至運(yùn)動后5h。其中1只大鼠在跑臺運(yùn)動中探針被撞彎，無法行微透析采樣，故予以剔除。

1.5 核團(tuán)定位準(zhǔn)確性檢驗(yàn)

DRN微透析結(jié)束（即運(yùn)動后5h）時，大鼠用戊巴比妥鈉過量麻醉后經(jīng)升主動脈弓灌注前固定后，取全腦置4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度脫水后行冰凍切片（30μm），用 Nissle（焦油紫）染色，觀察微透析探針 DRN定位準(zhǔn)確性。其中剔除DRN定位不準(zhǔn)者5只。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 記錄毛刷刺激頻次

為了維持實(shí)驗(yàn)大鼠完成1h跑臺運(yùn)動，運(yùn)動中在大鼠尾部給予毛刷刺激；記錄每分鐘實(shí)施的毛刷刺激次，用以觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的運(yùn)動主動性及其體能狀態(tài)。

1.6.2 血漿f-TRP、T-TRP含量測定

血漿提取：DRN微透析結(jié)束（即運(yùn)動后5h）時，大鼠用過量2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，經(jīng)腹主靜脈采血3ml，1%肝素鈉（50μl）抗凝，3000r/min離心 15min后取上清。

樣品前處理：取500μl血漿2份，分別加入 0.36g硫酸銨和等體積5%HClO4溶液，渦旋混勻0.5～1min，室溫靜置10min，10000r/m低溫離心15min。分取上清液，前者為f-TRP，后者為 T-TRP，經(jīng) 0.22μm濾膜過濾，置-80℃保存以待檢測。

血漿TRP含量檢測采用HPLC-UV法［8］，色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（Agilent公司）ODSC18柱（4.6mm×150mm，5μm 顆粒）；流動相：乙腈-水溶液（8:92，V/V），用冰醋酸調(diào)pH為3.4；流速：1ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：215nm；進(jìn)樣量：20μl。

1.6.3 血漿BCAA含量測定

于運(yùn)動后5h，取血漿檢測。血漿采用趙劍虹［9］報(bào)道的方法進(jìn)行柱前衍生處理，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)樣；血漿 BCAA含量檢測采用 HPLC-UV法，參考趙氏［11］方法進(jìn)行改進(jìn)。色譜柱：同上；流動相：乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH5.2）-乙腈，梯度洗脫：0min（80:20）—20min（70:30）—25min（40:60）；流速：1ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：360nm；進(jìn)樣量：20μl。

1.6.4 DRN細(xì)胞外液5-HT含量測定

于運(yùn)動前、運(yùn)動后即刻及運(yùn)動后 1h、2h、3h、4h、5h時，檢測DRN細(xì)胞外液中5-HT含量。采用HPLC-ECD法［10］，色譜柱：MD-150（ESA 公司）ODS-C18柱（3.2mm×150mm，3μm 顆 粒）； 流 動 相 ：75mM NaH2PO4·H2O、1.7mM 1-辛 烷 磺 酸 鈉 、100μl/LTEA、25μM EDTA、10%乙腈；流速：0.6ml/min；柱溫：32℃；電化學(xué)檢測器參數(shù)：E1：-150mV；E2：+220mV；EGC：+270mV；鈀為參比電極；Full Scale/Range：10nA；進(jìn)樣量：20μl。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動中毛刷刺激頻次

如表1所示，運(yùn)動組大鼠在1h持續(xù)跑臺運(yùn)動中毛刷刺激頻次顯著多于TEAS組（P<0.05）。

表1 兩組大鼠運(yùn)動中毛刷刺激頻次比較（次/min）

2.2 血漿f-TRP、T-TRP含量及f-TRP/T-TRP比值

表2顯示，TEAS組血漿T-TRP含量與運(yùn)動組無明顯差異（P>0.05）,但TEAS組血漿f-TRP含量和f-TRP/T-TRP比值顯著低于運(yùn)動組（均P<0.01）。

表2 兩組大鼠血漿f-TRP、T-TRP含量及f-TRP/T-TRP比值比較

2.3 血漿BCAA含量及f-TRP/BCAA比值

由表3可見，兩組大鼠血漿BCAA及其組成氨基酸L-VAL、L-ILE、L-LEU 含量比較均無顯著差異（P>0.05），而TEAS組血漿f-TRP/BCAA比值顯著低于運(yùn)動組（P<0.05）。

表3 兩組大鼠血漿BCAA含量及f-TRP/BCAA比值比較

2.4 DRN細(xì)胞外液5-HT水平

運(yùn)動前，運(yùn)動組和TEAS組大鼠DRN細(xì)胞外液中的基礎(chǔ)5-HT水平分別為 36.97±6.49、53.19±12.49（pg/20μl），兩組間比較無差異（P>0.05）。1h運(yùn)動中，DRN 細(xì)胞外液中5-HT含量的動態(tài)變化如圖1所示，運(yùn)動組大鼠DRN細(xì)胞外液5-HT水平運(yùn)動后即刻顯著升高（P<0.05），隨后呈下降趨勢，運(yùn)動后1h時顯著降低（P<0.05）；持續(xù)降低2h后，運(yùn)動后3、4h時又有回升，顯著高于運(yùn)動后2h時（P<0.05）。TEAS組運(yùn)動后DRN細(xì)胞外液中5-HT水平與基礎(chǔ)值相當(dāng)，但均低于同期運(yùn)動組，在運(yùn)動后4h開始有較明顯下降，運(yùn)動后5h時明顯低于運(yùn)動組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

運(yùn)動性疲勞屬于中醫(yī)“虛勞”、“勞倦”、“勞傷”等范疇，雖在中醫(yī)經(jīng)典理論未有明確的論述，但對于與現(xiàn)代疲勞論述相關(guān)的由形體過用產(chǎn)生的“勞、傷、虛、損”的相關(guān)記載卻頗為詳盡?！捌凇币辉~始見于《金匱要略》，書中明確地把疲勞引起的證候與“虛勞病”作為同類進(jìn)行論述；關(guān)于運(yùn)動性疲勞的病因，《素問》載有“生病起于過用”一說，《素問·宣明五氣篇》則明確指出“久視傷血，久臥傷氣，久坐傷肉，久立傷骨，久行傷筋”。經(jīng)皮穴位電刺激（TEAS）是一種將經(jīng)皮神經(jīng)電刺激和穴位特異性相結(jié)合的新型針灸療法，具有無創(chuàng)性、刺激定量化、不受體位限制、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。足三里穴屬多氣多血之經(jīng)足陽明胃經(jīng)之合穴，又為胃之下合穴，一貫被歷代醫(yī)家視為補(bǔ)虛培元、強(qiáng)壯保健要穴。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到TEAS足三里穴后可顯著減少大鼠運(yùn)動中使用毛刷刺激頻次，表明TEAS足三里穴能明顯改善實(shí)驗(yàn)大鼠體能狀態(tài)，提高其運(yùn)動主動性。

運(yùn)動性疲勞的發(fā)生機(jī)制主要包括存在于大腦的中樞機(jī)制和肌肉的外周機(jī)制兩個方面。越來越多的證據(jù)表明運(yùn)動性疲勞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著更密切的關(guān)系，因而認(rèn)為運(yùn)動造成中樞疲勞［11］。Newsholme首次提出中樞性疲勞假說，認(rèn)為長時間運(yùn)動增加腦內(nèi)5-羥色胺能活性導(dǎo)致運(yùn)動性疲勞從而影響運(yùn)動能力的恢復(fù)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究亦表明持續(xù)運(yùn)動可引起多個腦區(qū) 5-HT含量的升高［12，13］。5-HT激動劑和拮抗劑的應(yīng)用，更進(jìn)一步證實(shí)5-HT與運(yùn)動性疲勞之間的因果關(guān)系［14，15］。TRP是5-HT合成的前體物質(zhì)，外周僅f-TRP與BCAA競爭載體穿透血腦屏障，運(yùn)動可促使外周血中f-TRP/BCAA比值升高，進(jìn)而腦內(nèi)TRP含量增加，最終中樞神經(jīng)細(xì)胞合成的5-HT亦相應(yīng)增多，中樞疲勞繼之而來［16］。因此，血漿f-TRP而不是T-TRP被認(rèn)為是運(yùn)動中決定腦TRP攝入率的重要因素。

實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到TEAS組大鼠血漿T-TRP水平與運(yùn)動組比較無顯著差異，但血漿f-TRP含量則顯著降低；進(jìn)一步計(jì)算血漿f-TRP/T-TRP比值以觀察血漿TRP的游離程度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TEAS治療，跑臺運(yùn)動大鼠血漿TRP游離率顯著降低。此外，兩組血漿BCAA水平無顯著變化，這可能與采血時間在運(yùn)動后5h時，在運(yùn)動中消耗的BCAA可能在休息后得到恢復(fù)有關(guān)。血漿f-TRP/BCAA比值結(jié)果顯示，TEAS組顯著低于運(yùn)動組，表明TEAS可有效抑制血漿f-TRP穿越血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)。王芳等［17］也觀察到運(yùn)動后血漿f-TRP/BCAA比值顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TEAS足三里穴后可明顯降低血漿TRP游離率，減少f-TRP穿透血腦屏障，進(jìn)而間接地抑制腦內(nèi)5-HT的生成。

本實(shí)驗(yàn)采用微透析檢測DRN中5-HT含量動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動大鼠DRN細(xì)胞外液5-HT水平分別在運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后3h時呈上升趨勢。Gomez-Merino等［18，19］也觀察到跑臺運(yùn)動大鼠海馬細(xì)胞外液5-HT水平從運(yùn)動后即刻的 123.7±6.4%增至休息 1h時的 133.9±6.4%；皮層和海馬細(xì)胞外液5-HT水平在運(yùn)動90min后顯著升高，并在休息30min后達(dá)到最高，提示大鼠運(yùn)動后腦內(nèi)5-HT水平可能存在持續(xù)性升高。本實(shí)驗(yàn)中，TEAS組大鼠各時段DRN內(nèi)5-HT水平均低于運(yùn)動組，并呈逐漸下降趨勢，提示TEAS足三里穴可下調(diào)DRN細(xì)胞外液5-HT水平，并有可能參與運(yùn)動性疲勞的恢復(fù)。Lee等［20］采用免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)電針足三里穴可有效抑制跑臺運(yùn)動大鼠DRN內(nèi)5-HT合成增加，由此推斷針灸足三里穴不但干預(yù)DRN內(nèi)神經(jīng)元胞內(nèi)5-HT合成，還可影響釋放至胞外5-HT水平的高低。綜上所述，TEAS足三里通過降低血漿-TRP含量、減少其向中樞的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而間接地降低了腦內(nèi)5-HT合成，延緩運(yùn)動性疲勞的發(fā)生，進(jìn)而促使運(yùn)動能力提高。

4 總結(jié)

TEAS足三里穴能明顯改善實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動的主動性和體能狀態(tài)，其提高運(yùn)動能力的效應(yīng)可能是通過降低血漿TRP游離度和f-TRP轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，進(jìn)而減少腦內(nèi)5-HT合成實(shí)現(xiàn)的。

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