玉米核心種質(zhì)及構(gòu)建方法研究進(jìn)展

李健英，解 睿，李正莉，曹宇賓，郭俊宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031）

玉米栽培歷史悠久，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇，形成了極其豐富的種質(zhì)資源，蘊含豐富的遺傳多樣性。大范圍的玉米地方品種資源的收集整理始于1943年，當(dāng)時洛克菲勒基金會和墨西哥農(nóng)業(yè)部啟動了一個針對玉米品種資源的合作項目。從20世紀(jì)70年代開始，更多的國家開始玉米種質(zhì)資源的收集工作。隨著種質(zhì)資源收集工作的啟動與發(fā)展，種質(zhì)資源數(shù)目的急劇增加，給資源的管理、評價、鑒定等工作造成了很大的障礙。針對這一問題，F(xiàn)rankel和Brown于1984年提出了基于遺傳多樣性構(gòu)建核心種質(zhì)的解決方案，為遺傳資源的研究和利用提供了嶄新的解決途徑。

1 玉米種質(zhì)資源的收集與各國核心種質(zhì)的構(gòu)建研究

在世界主要的基因庫大約保存有65 000份玉米材料，90%是栽培玉米（Zmays）[1]。玉米的多樣性中心在中南美洲。CIMMYT有著世界上最大的玉米基因庫，保存有25 609份玉米材料，來自64個國家，其中21 767份來自中南美洲。據(jù)美國國家種質(zhì)系統(tǒng)顯示，截止2009年11月底，美國保存有26 647份玉米種質(zhì)材料，來自100多個國家。玉米15世紀(jì)傳入歐洲和亞洲，1996年歐洲農(nóng)作物遺傳資源網(wǎng)合作計劃在羅馬召開會議，建立玉米中心數(shù)據(jù)庫的提議得到16個參會國家18位代表的支持，會后在塞爾維亞Zemun Polje玉米研究所建立歐洲玉米數(shù)據(jù)庫，保存有13個國家11 865份玉米種質(zhì)材料的信息。我國也具有豐富的玉米種質(zhì)資源，截止到20世紀(jì)90年代末，我國所收集到的玉米地方品種已經(jīng)達(dá)到了玉米總資源的76.65%，在我國玉米種質(zhì)庫中保存有17 000多份材料[2]。

構(gòu)建核心種質(zhì)受到了世界各國的廣泛重視。在對所保存種質(zhì)資源試驗、鑒定、評價的基礎(chǔ)上，世界各國都開展了構(gòu)建玉米核心種質(zhì)的研究（表1）。拉丁美洲玉米計劃（LAMP）是第1個合作鑒定玉米種質(zhì)資源的國際項目，共有巴西、玻利維亞、哥倫比亞、智利、危地馬拉、墨西哥、其有巴拉圭、秘魯、烏拉圭、委內(nèi)瑞拉、美國、阿根廷12個國家參加，項目第1期按玉米種族分組進(jìn)行50多次試驗，鑒定7 312份材料，構(gòu)建31個初級核心子集或育種核心子集[3]。歐洲啟動RESGEN CT96-088項目，對意大利、德國、法國、希臘、葡萄牙、西班牙以及荷蘭的玉米地方品種進(jìn)行了表型多樣性評價，構(gòu)建了各國核心種質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分子多樣性評價，構(gòu)建了歐洲玉米核心種質(zhì)。CosmosMagorokosho[1]對津巴布韋、贊比亞、馬拉維收集的地方品種進(jìn)行了表型和DNA水平上的多樣性鑒定，構(gòu)建了核心種質(zhì)。日本基于AFLP多態(tài)性，從保存在國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（NIAS）基因庫的300份和1 000份的玉米材料中分別選出17個北海道和69個其他材料構(gòu)成日本玉米地方品種核心庫。中國農(nóng)科院依據(jù)所收集種質(zhì)的基礎(chǔ)信息以及表型特性評價了中國國家種質(zhì)庫中所收錄的13 521份地方品種和3 258份自交系，分別構(gòu)建了核心種質(zhì)庫[2]。在此基礎(chǔ)上，劉志齋[4]采用SSR標(biāo)記構(gòu)建了中國地方品種的微型核心庫。Yu等[5]分析了288個自交系（其中242個來自中國國家種質(zhì)庫自交系核心庫）49個SSR位點的多態(tài)多樣性，構(gòu)建了中國自交系微型核心子集。

表1 世界各國構(gòu)建玉米核心種質(zhì)研究及取樣策略

2 構(gòu)建玉米核心種質(zhì)的取樣策略研究

種質(zhì)資源的多樣性不是隨機的，而是有一定的組織和結(jié)構(gòu)。歸納核心種質(zhì)的構(gòu)建，實質(zhì)上是將其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分層，也就是分組、分類，深層地揭示其結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上取樣。玉米核心種質(zhì)構(gòu)建偏重于取樣策略研究，即各種標(biāo)準(zhǔn)和方法在分類取樣中的應(yīng)用。

2.1 構(gòu)建數(shù)據(jù)的采用

核心種質(zhì)構(gòu)建通過基本信息數(shù)據(jù)和農(nóng)藝、形態(tài)性狀等數(shù)據(jù)的參與分析，利用各性狀的差異來剔除親緣關(guān)系相近的樣品并抽取核心樣品。各研究采用的性狀及其數(shù)目有所不同，巴西核心種質(zhì)構(gòu)建采用18個性狀數(shù)據(jù)[6]，CIMMYT育種核心子集的構(gòu)建采用了15個性狀數(shù)據(jù)[7]。

各性狀對變異有不同的貢獻(xiàn)[8]，因此研究中還涉及到性狀的取舍。主成分分析是篩選用于構(gòu)建核心種質(zhì)性狀的一種方法，剔除對變異貢獻(xiàn)極小的性狀，去除冗余性狀對分析的影響，提高分析效率。MarcosMalosetti等[9]在構(gòu)建核心種質(zhì)時，對852份玉米種質(zhì)的17個性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，去掉6個與主成分不相關(guān)的變量，然后取11個性狀作為構(gòu)建數(shù)據(jù)。一些研究也先后在核心種質(zhì)的研究中證實了主成分分析去除冗余數(shù)據(jù)的有效性。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的多樣性研究，從DNA水平上反映種質(zhì)材料的遺傳差異。玉米核心種質(zhì)構(gòu)建也越來越趨向于利用分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP和SSR。

2.2 玉米核心種質(zhì)第一層次分組標(biāo)準(zhǔn)

構(gòu)建玉米核心種質(zhì)庫，一般進(jìn)行2個層次的分組（類），地理來源和粒型是第一層次分組的重要標(biāo)準(zhǔn)，其他有玉米種族、育種體系。

地理來源和粒型與遺傳多樣性密切相關(guān)。地理來源與多樣性分布的相關(guān)性已普遍得到認(rèn)同。Malosetti指出，粒型與玉米馴化的不同階段有關(guān)，各粒型與玉米馴化不同階段的時間順序是爆裂—硬質(zhì)—粉質(zhì)—馬齒，馬齒是最現(xiàn)代的類型。從研究的空間分布也觀察到，爆裂玉米是離馬齒玉米最遠(yuǎn)的小組，而其他粒型介于他們之間。而且研究也表明，遺傳特性的分布往往與生態(tài)地理區(qū)域是一致的?；诘乩韥碓春土Ｐ头纸M有其合理性，地理來源表示的是不同的進(jìn)化方向，粒型表示的是不同的進(jìn)化起源。

Malosetti在對構(gòu)建烏拉圭地方種核心種質(zhì)的取樣策略研究中，比較了玉米種族、地理來源、地理來源+粒型的分組標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為地理來源+粒型分組標(biāo)準(zhǔn)好于種族分組標(biāo)準(zhǔn)，并且所進(jìn)行的判別分析也證實，地理來源+粒型表現(xiàn)出很高的正確分組[9]。

2.3 聚類方法研究

在第一層分類基礎(chǔ)上，采用什么樣的取樣策略一直是玉米核心種質(zhì)研究中的一個熱點與重點。成功的取樣策略取決于聚類方法、遺傳距離算法、組（類）內(nèi)取樣量計算方法、組內(nèi)取樣方法。聚類方法的目的是尋找數(shù)據(jù)中潛在的自然分組結(jié)構(gòu)，不加權(quán)類平均法（UPGMA）和離差平方和法（Ward）是構(gòu)建玉米核心種質(zhì)采用的2種主要方法。

聚類方法對構(gòu)建結(jié)果的影響是構(gòu)建玉米核心種質(zhì)的重要研究內(nèi)容。Rincon等[10]用墨西哥2個地點2年的玉米田間試驗數(shù)據(jù)比較了4種聚類方法——UPGMA、最短距離法、重心法和Ward方法。評價時使用2組數(shù)據(jù)，不同類型和數(shù)目的性狀，平均的平方歐氏距離作為相異性量度，在性狀類型和數(shù)目不同的情況下，UPGMA對類的劃分是一致的，而且，同最短距離法和Ward方法比較，UPGMA表現(xiàn)出較高的同表象相關(guān)系數(shù)。Franco的比較研究也表明，對于距離算法，UPGMA總是優(yōu)于Ward，所構(gòu)建的核心子集有顯著的多樣性[11]。

單一的方法并不是最好的解決方案，玉米核心種質(zhì)構(gòu)建中的一個趨勢是各種方法的結(jié)合應(yīng)用，如聚類分析與主成分分析或判別分析結(jié)合應(yīng)用，用主成分分析證實聚類結(jié)果并且研究分組的空間關(guān)系。再如基于距離和基于模型的聚類方法結(jié)合應(yīng)用，吸納二者的特點，進(jìn)行互補，最終使聚類方法具有統(tǒng)計性質(zhì)，從而形成更好的解決方案?；诰嚯x和基于模型聚類方法的結(jié)合經(jīng)歷了一步步地發(fā)展與改進(jìn)，從Ward-Gaussian混合模型到Ward-LM模型再到Ward-MLM模型，解決了Gaussian模型只能利用連續(xù)變量、LM模型沒有考慮到大數(shù)據(jù)集經(jīng)常會出現(xiàn)空單元的問題。

Ward-MLM方法是Franco等[12]在玉米核心種質(zhì)構(gòu)建中提出的，又叫兩步Ward-MLM分類策略。第1步使用系統(tǒng)聚類方法Ward方法分組，第2步通過MLM模型改進(jìn)、優(yōu)化第1步劃分的小組，其中采用了2種規(guī)則，upper-tail方法（也叫Mojena指數(shù)）和最大似然比檢驗。MLM模型在形狀、方向和體積上優(yōu)化在多維空間中所分布的點群（Ward方法獲得）。

Ward-MLM分類策略用Gower距離度量樣品間的相似性，把分類變量結(jié)合在一個多項式變量中，實現(xiàn)了連續(xù)變量和有序變量同時參與分析。這一策略的特點是：（1）優(yōu)化目標(biāo)函數(shù)，如第1步中的組內(nèi)平方和，第2步中的似然函數(shù)；（2）進(jìn)行統(tǒng)計檢驗確定最佳的小組數(shù)目；（3）可以度量所分組的質(zhì)量和確定組內(nèi)成員身份的概率；（4）同時考慮到連續(xù)變量和分類變量的重要性，包括所有可以利用的信息，沒有變量被排除在分析之外[13]。Ward-MLM策略可以同時使用表型數(shù)據(jù)和遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)，如果只使用分子標(biāo)記和DNA片段數(shù)據(jù)，可采用各種聚類方法和各種距離度量。

Franco等[14]還把Ward-MLM法擴展到了基因型×環(huán)境×性狀的三向數(shù)據(jù)分類分析中，并比較了兩步Ward-Gaussian方法和兩步Ward-MLM方法，研究證實，連續(xù)變量和分類變量在最后的分組中都有其重要性；比較研究表明，基于連續(xù)變量構(gòu)成的小組沒有清楚地表現(xiàn)出分類變量的反應(yīng)模式，而基于連續(xù)變量和分類變量構(gòu)成的小組則明顯地表現(xiàn)出2種變量的反應(yīng)模式。兩步Ward-MLM方法能夠很好地恢復(fù)模擬數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)，所劃分的加勒比玉米材料組與地理來源有很明顯的關(guān)聯(lián)。Franco等[15]2002年對2組玉米數(shù)據(jù)和1組小麥數(shù)據(jù)的研究表明，三向Ward-MLM聚類所劃分的組在各環(huán)境下有相似的性狀反應(yīng)，獲得了交叉互作小的同質(zhì)組。

2.4 組（類）內(nèi)取樣量計算方法研究

在取樣策略中，組（類）內(nèi)取樣量計算方法決定從類內(nèi)抽取樣品的數(shù)目。研究中提出多種組（類）內(nèi)取樣量計算方法，有R方法、C方法、L方法、P方法，隨著分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的采用，后來又提出H方法和M方法。L方法和P方法是構(gòu)建玉米核心種質(zhì)常用的方法。

研究表明，P方法偏重于容量大的組（類），L方法偏重于容量小的組（類），L方法高度取決于分組方法。Schoen和Brown使用估計位點和目標(biāo)位點數(shù)據(jù)比較了6種組（類）內(nèi)取樣量計算方法，結(jié)果表明，按從高到低的排列，期望的等位基因保持率為M＞H＞P＞L＞C＞R[16]。

組（類）內(nèi)取樣量計算方法可以分為2類：基于組（類）容量，基于多樣性。Franco提出的D方法則屬于后者，每類的取樣量與類內(nèi)樣品間Gower距離的平均值成比例，也就是取樣量與平均Gower距離度量的組內(nèi)多樣性成比例，其原則是多樣性大的組其平均Gower距離也大，因此，所取樣品量也應(yīng)較多。D方法可以使用任何聚類方法和任何距離量度。

Franco采用的4組數(shù)據(jù)集（危地馬拉玉米種質(zhì)、巴西玉米種質(zhì)、墨西哥玉米種質(zhì)、Pool25（S2品系與一測交種雜交））樣品量大小不一，多樣性值不同，而且類的數(shù)目也不同，采用Ward-MLM策略，進(jìn)行了D方法與其他方法的比較。根據(jù)樣品的多樣性、樣品變量極值的恢復(fù)、樣品的方差3個標(biāo)準(zhǔn)，D方法所構(gòu)建核心種質(zhì)樣品間的平均Gower距離大，恢復(fù)的變量極值多，核心種質(zhì)方差也大，而且都顯著。D方法是一種有效的方法，保存了原群體的多樣性，適合成為構(gòu)建核心種質(zhì)的一個標(biāo)準(zhǔn)[17]。

2.5 多因素綜合比較

為了研究各因素對取樣策略的影響，F(xiàn)ranco等[18]進(jìn)行了綜合研究，比較了2種聚類方法UPGMA和Ward，2種遺傳距離算法修正的Roger（MR）及Cavalli-Sforza和Edwards（CE），6種組（類）內(nèi)取樣量計算方法P，L，D-修正的Rogers或 D-Cavalli-Sforza（D-MR 或 D-CE）、D-Shannon index（D-SH，與Shannon多樣性指標(biāo)成比例）、D-Heterozygous（D-HE，與每一個體雜合位點的期望比成比例）、D-Effective alleles（D-NE，與有效等位基因數(shù)目成比例）共24個組合，采用分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，3組數(shù)據(jù)集，即混合數(shù)據(jù)集來自美國和歐洲的玉米地方品種，種質(zhì)數(shù)據(jù)集來自墨西哥的地方品種，群體數(shù)據(jù)集把墨西哥的地方品種每一群體的個體分組，計算每一群體的等位基因頻率。

研究的評價標(biāo)準(zhǔn)是核心子集樣品間平均遺傳距離最大（MRs或CEs），等位基因豐度最大（SHs，HEs和 NEs），無信息等位基因（none-informative allele）比例最?。≒Ns）。對于混合數(shù)據(jù)集，核心子集樣品間平均遺傳距離（MRs和CEs）主要受組內(nèi)取樣量計算方法和聚類方法影響，受聚類方法×組內(nèi)取樣量計算方法互作和聚類方法×距離互作影響較小。對于多樣性指數(shù)（SHs，HEs和NEs）聚類方法×距離是變異性的重要來源。對于種質(zhì)數(shù)據(jù)集，聚類方法的主效應(yīng)是所有反應(yīng)變量變異性的重要來源，其次是聚類方法×組內(nèi)取樣量計算方法互作和組內(nèi)取樣量計算方法主效應(yīng)。多樣性指數(shù)SHs和NEs主要受聚類方法×距離互作影響，MRs，CEs和HEs受其影響較小。PNs僅受聚類方法影響。

3 組數(shù)據(jù)集的研究結(jié)果表明，對于評價標(biāo)準(zhǔn)MRs和CEs，UPGMA總是優(yōu)于Ward；CE距離優(yōu)于MR距離；最好的組內(nèi)取樣量計算方法是D-MR，D-CE或D-NE。

研究還與M方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，M方法能夠有效地構(gòu)建等位基因豐度高、無信息等位基因比例低的核心種質(zhì)。按遺傳距離最大化的評價標(biāo)準(zhǔn)（育種家的角度），D方法總是優(yōu)于M方法；按遺傳多樣性的評價標(biāo)準(zhǔn)（分類學(xué)家角度），D方法相似或次于M方法。

2.6 針對特殊目的的核心種質(zhì)構(gòu)建

依據(jù)形態(tài)性狀構(gòu)建的核心庫并不能很好地捕捉與玉米籽粒特性有特殊關(guān)聯(lián)的變異。Campbell等[19]嘗試了另外的方法，對306份智利低地亞熱帶和溫帶玉米群體利用近紅外透射光譜法構(gòu)建以玉米籽粒品質(zhì)為目的的核心種質(zhì)，樣品的平均頻譜轉(zhuǎn)換為對數(shù)，然后再用多元散射校正轉(zhuǎn)換，最后進(jìn)行主成分分析。

用第一主成分和第二主成分作圖，將圖人為地分割為5×5格，共有25個單元，在同一單元內(nèi)的樣品具有相似的頻譜，因而認(rèn)為其具有相似的品質(zhì)特性，有冗余，從每一單元的中央取一樣品構(gòu)成有16個樣品的核心種質(zhì)，具有多樣性。

3 深層次研究各方法的優(yōu)點、局限性及有效性

合理有效的取樣策略是構(gòu)建核心種質(zhì)的關(guān)鍵，雖然玉米核心種質(zhì)的研究有很大進(jìn)展，但對于不同遺傳距離、不同的系統(tǒng)聚類方法及不同抽樣方法構(gòu)建核心種質(zhì)的優(yōu)點與局限性及有效性還需深入研究。例如，參與分析的性狀及其數(shù)目對分析結(jié)果的影響；距離算法對分類的影響；各種層次或水平上的數(shù)據(jù)，如生態(tài)、生物化學(xué)、分子標(biāo)記等數(shù)據(jù)的結(jié)合應(yīng)用，以使核心種質(zhì)的構(gòu)建結(jié)果更加可靠。

［1］ Cosmos Magorolosho.Genetic Diveristy and Performance of Maize Varieties from Zimbabwe，Zambia and Malawi[EB/OL].[2009-09-16]http://txspace.tamu.edu/bitstream/1969.1/4669/1/etd-tamu-2006C-PLBR-Magorok.pdf.

［2］ LiY，ShiY S，Cao Y S，etal.Establishmentofa core collection formaize germplasm preserved in Chinese National Genebank usinggeographic distribution and characterization data[J].Genetic Resourceand Crop Evolution，2004，51：845-852.

［3］ Taba S，JDíaz，JFranco，etal.A Core subsetof LAMP,from the Latin American Maize Project[EB/OL].[2009-10-07]http://apps.cimmyt.org/enslish/wps/publs/Catalogdb/index.cfm.

［4］ 劉志齋.中國玉米地方品種的多樣性研究與種族劃分[EB/OL].[2009-10-07]http://ln.wanfangdata.com.cn/D/Thesis_Y1264298.aspx.

［5］ Yu Y，Wang R，ShiY，etal.Genetic Diversity and Structure of the Core Collection forMaize Inbred Lines in China[J].Maydica，2007，52（2）：181-194.

［6］ Ronaldo R.Developmentofa Brazilianmaize core collection[J].Geneticsand Molecular Biology，2009，32（3）：538-545.

［7］ Suketoshi Taba.The CIMMYTMaize Collection:Evaluation of the Accessions and Preliminary Breeder Core Subset[EB/OL].[2009-10-07]http://www.cimmyt.org/Research/Maize/symposium/posters/taba_cimmyt.pdf.

［8］ 喬治軍，張效梅，暢建武.山西玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和利用研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（3）：28-30.

［9］ Marcos Malosetti，Tabare Abadie.Sampling strategy to develop a core collection of Uruguayanmaize landraces based on morphological traits[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2001，48：381-390.

［10］ Rincon F，Johnson B，Crossa J，etal.Cluster analysis,an approach to sampling variability inmaizeaccessions[J].Maydica，1996，41（4）：307-316.

［11］ Franco J，Crossa J，Villasenor J，et al.Classifying Mexican maizeaccessionsusinghierarchicaland density searchmethods[J].Crop Sci，1997，37：972-980.

［12］ Franco J，Crossa J，Villasenor J，etal.Classifying Genetic Resourcesby Categoricaland Continuous Variables[J].Crop Sci，1998，38：1688-1696.

［13］ MohammadiSA，Prasanna BM.Analysisof Genetic Diversity in Crop Plants-SalientStatistical Tools and Considerations[J].Crop Science，2003，43：1235-1248.

［14］ Franco J，Crossa J，Villasenor J，etal.A two-stage,three-way method for classifying genetic resources in multiple environments[J].Crop Sci，1999，39：259-267.

［15］ Franco J，Crossa J，Suketoshi Taba，et al.A Multivariate Method for Classifying Cultivars and Studying Group×Environment×Trait Interaction[J].Crop Science，2003，43：1249-1258.

［16］ Elanmon S，Hodgkin T，DussertS，etal.Core Collection:Theoretical and Applied Aspects[EB/OL].[2009-10-09]http://horizon.documentation.ird.fr/exl-doc/pleins_textes/pleins_textes_6/b_fdi_35-36/41234.pdf.

［17］ Franco J，Crossa J，Taba S，etal.A Sampling Strategy for ConservingGenetic Diversitywhen Forming Core Subsets[J].Crop Sci，2005，45（3）：1035-1044.

［18］ Franco J，Crossa J，Warburton M L，etal.Sampling Strategies for Conserving Maize Diversity When Forming Core Subsets UsingGenetic Markers[J].Crop Sci，2006，46（2）：854-864.

［19］ Campbell M R，Anih E，Conatser C，et al.Development of a core subset of Chilean lowland subtropical and temperate maize（Zeamays L）populationsusingnear infrared transmittance spectroscopy[J].Plant Genetic Resources Newsletter，2006，148：1-9.