“菊花的組織培養(yǎng)”實驗材料及方法的改進

摘要 將實驗材料菊花莖段改為本實驗室易得的煙草葉片，并且優(yōu)化人教版選修1教材中MS培養(yǎng)基的配制方法，這樣實驗可操作性強，學生可觀察到生長素、細胞分裂素誘導煙草葉片分化的明顯實驗現(xiàn)象，教學效果好。

關鍵詞 植物組織培養(yǎng) 實驗材料 方法

中圖分類號 Q-33

文獻標識碼 B

在普通高中《生物課程標準》(實驗)的《生物技術實踐》模塊中，植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”。嘗試是技能性目標中的模仿水平，即學生仿照教師的示范性動作完成對實驗對象的操作。

植物組織培養(yǎng)是一項操作難度較大的實踐活動，其操作流程包括：配制母液、制備MS固體培養(yǎng)基、外植體消毒、接種、培養(yǎng)、移栽、栽培等操作環(huán)節(jié)。在實際操作中難以一次完成，又由于所教的班級多，實驗材料——菊花，本地購買也不方便，所以，對“菊花的組織培養(yǎng)”實驗的材料和方法步驟及實驗設計都進行了改進，從而使實驗可操作性增強，效果變好，并且將實驗內(nèi)容分為兩個，一周做一個，保證能在有限的時間內(nèi)順利地開展實驗教學。

1 實驗一：MS培養(yǎng)基的配制

1.1 實驗原理

MS培養(yǎng)基的成份分為四大類：大量元素、微量元素、有機物和植物激素。培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)目的，可加入不同種類及濃度的激素即生長素類和細胞分裂素類，而且植物激素的濃度、使用的先后順序及用量的比例等，都會影響實驗的結果。但由于班級多，儀器數(shù)量有限，只嘗試了加植物激素和不加植物激素兩種條件下煙草葉片長出愈傷組織的情況。

1.2 實驗儀器、藥品

電腦程控壓力蒸汽滅菌鍋(長春百奧)，微波爐，天平，三角瓶(200mL和500mL)，燒杯，量筒，量杯(500mL和1000mL)，橡皮筋，封口膜，報紙，移液管，玻璃棒，普通水浴鍋，精密pH試紙。

NAA母液1mg／l，6-BA母液1mg／L，培養(yǎng)基母液，pH試紙，瓊脂粉，蔗糖，蒸餾水。

1.3 實驗步驟

1.3.1 實驗設計(表1)

1.3.2 配置各種母液

大量元素20倍：用天平(按人教版選修一教材第84頁中關于MS培養(yǎng)基的內(nèi)容)取藥品，分別加600mL左右蒸餾水溶解后，再用玻璃棒攪拌，促進溶解。注意CaCl₂不易溶解，單獨溶解后再倒入1000mL量杯中，再加蒸餾水定容至刻度，成為20倍母液。

微量元素200倍：用天平按表稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。

有機物200倍：按表分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容至1000mL。

鐵鹽母液500倍：按表稱取藥品，加熱促進溶解，混合后加水定容至1000mL。

萘乙酸母液(NAA)1mg／mL：用少量1N NaOH溶解后，蒸餾水定容。

6－芐基嘌呤母液(6－BA)1mg／mL：用少量1N HC1溶解后，蒸餾水定容。

配制好的母液瓶上應分別貼上標簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時應取的量，并放入4℃冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。貯藏期間如發(fā)現(xiàn)有霉菌污染或有沉淀結晶產(chǎn)生，就必須丟棄不用。

1.3.3 配制培養(yǎng)基

(1)將各種儀器(量杯、量筒、燒杯、移液管、玻璃棒等)、蒸餾水、橡皮筋、封口膜等放置在實驗臺上。

(2)稱量好所需要的瓊脂粉(8g/L)、蔗糖(30g/L)。

(3)取1000mL量杯(配置1000mL培養(yǎng)基)，加入600mL左右蒸餾水，30g蔗糖，大量元素貯存液50mL，微量元素和有機物貯存液5mL，鐵鹽貯存液2mL。

(4)加生長素NAA 200μL(終濃度為0.2mg／L)，細胞分裂素6-BA 2mL(終濃度為2mg／L)。

(5)用1N鹽酸和1N氫氧化鈉調(diào)pH至5.8，并用玻璃棒攪拌均勻。

(6)添加蒸餾水至刻度，定容至1000mL。

(7)將稱量好的瓊脂粉1.6g倒入200mL三角瓶中。每瓶120 mL(注意不要粘到瓶口和瓶壁上)。

(8)用封口膜封口，橡皮筋纏好，貼標簽或用記號筆寫明培養(yǎng)基編號，組別。

(9)高壓滅菌，將三角瓶擺放在高壓蒸汽滅菌鍋的筐里，上面覆蓋一層報紙，121℃蒸汽滅菌20min。

(10)滅菌結束后，待溫度降到90℃以下取出三角瓶，放在實驗臺上，放置一周備用。同時，為接種所需的無菌水，濾紙，鑷子和剪刀等也一并滅好菌。

2 實驗二：外植體消毒，接種和培養(yǎng)

2.1 實驗原理

離體的植物組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間以后，會通過細胞分裂形成愈傷組織。由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化，在這個過程中，往往要使用植物激素，人為地控制細胞的脫分化與再分化。

2.2 實驗材料、儀器和藥品

煙草，無菌操作臺，組培室，光照培養(yǎng)架，長柄鑷子，解剖刀，三角瓶，濾紙，70％酒精棉球，500mL噴壺，酒精燈。

10％安替福民(次氯酸鈉溶液)，95％乙醇，70％乙醇，無菌水。

2.3 實驗步驟

(1)用70％酒精棉球將無菌操作臺面擦一遍，70％酒精噴霧使操作臺內(nèi)外環(huán)境消毒，開啟超凈工作臺，紫外線照射消毒30min，通風30min，將濾紙，長柄鑷子，解剖刀，三角瓶，95％乙醇等放在操作臺上。

(2)加熱融化滅過菌的培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，每皿約20mL，半敞口冷卻凝固。

(3)取煙草幼嫩的葉片，自來水沖洗表面灰塵15min，放入10％安替福民溶液中3～5min，取出后，無菌水沖洗一次，移入無菌操作臺。

(4)在點燃的酒精燈附近，用無菌水再沖洗兩次后，滅菌濾紙吸干煙草葉片表面水分，首先將葉緣和葉柄切掉，然后將葉片切成0.5cm左右的小塊。

(5)長柄鑷子蘸95％酒精后在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻后將材料接種到培養(yǎng)基中，每皿6～10塊。

(6)在培養(yǎng)皿標簽上注明接種日期，并放置在組培室內(nèi)，光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，溫度25+2℃，光照強度為3000lμx，光／暗周期為16h／8h。兩周后可以看到明顯的實驗現(xiàn)象。

3 討論

在本實驗中，可將實驗分為兩部分，使實驗步驟詳細化，優(yōu)化MS培養(yǎng)基的配置方法：

(1)實驗過程中將傳統(tǒng)的瓊脂膠改為瓊脂粉，省掉了加熱融化的步驟，同時也增加了學生實驗的安全系數(shù)，節(jié)省了時間。

(2)與原教材相比，將定容過程放在調(diào)節(jié)pH之后，減少了實驗誤差。

同時還將實驗材料改為本實驗室易得的煙草，易于培養(yǎng)，并且按照教師設計的培養(yǎng)基，用植物激素誘導，學生看到了明顯的實驗現(xiàn)象，充分理解了植物激素的作用，收到了良好的教學效果。