脆性卵膜卵母細(xì)胞卵胞漿內(nèi)單精子注射的胚胎發(fā)育與臨床結(jié)局分析

戴旭，師娟子，薛俠，李偉，施文浩

(西安醫(yī)學(xué)院，西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710003)

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)是通過顯微操作技術(shù)直接將精子注射到卵胞漿內(nèi)，這項技術(shù)解決了許多因男方因素所導(dǎo)致的不育癥，在輔助生殖領(lǐng)域取得了極其廣泛的應(yīng)用[1]。正常情況下，在ICSI針刺入卵膜時卵胞膜有一定彈性，有破膜感。但臨床實際工作中發(fā)現(xiàn)部分卵胞膜表現(xiàn)為沒有彈性，這種ICSI針無阻力感直接破膜的卵胞膜定義為脆性卵膜。既往文獻報道脆性卵膜卵母細(xì)胞ICSI后受精能力下降，卵細(xì)胞退化率升高[2]，但臨床妊娠結(jié)局很少有報道。本研究主要探討在輔助生殖技術(shù)ICSI治療中出現(xiàn)脆性卵膜卵母細(xì)胞的臨床妊娠結(jié)局，分析其中可能的原因，為脆性卵膜提供可能的預(yù)防和治療措施。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月至2019年3月西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心的ICSI治療周期。排除供卵、供精、胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)周期的患者。精子注射時卵細(xì)胞膜表現(xiàn)為沒有彈性，ICSI針無阻力感直接破膜即為脆性卵膜組，共196 個周期。通過傾向值匹配(匹配容差為0.05)進行1∶2的匹配，產(chǎn)生對照組(無脆性破膜卵母細(xì)胞)共392 個周期納入本研究，匹配變量包括患者年齡、BMI、不孕因素、用藥方案。

二、研究方法

1.促排卵方案及卵細(xì)胞的獲?。焊鶕?jù)患者的具體情況選擇常規(guī)長方案、超長方案、短方案、拮抗劑、微刺激等方案促排卵，動態(tài)監(jiān)測卵泡發(fā)育以及血清性激素水平，當(dāng)直徑≥18 mm的卵泡≥2枚，或≥17 mm的卵泡≥3枚時，注射HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)5 000～10 000 U，注射后36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

2.精子準(zhǔn)備：患者取精前禁欲2～7 d，取卵當(dāng)天采用手淫方式留取精液，然后采用密度梯度離心法處理精液，選擇活動精子行ICSI。

3.卵母細(xì)胞準(zhǔn)備：將卵冠丘復(fù)合物(OCCCs)置于透明質(zhì)酸酶(Irvine Scientific，美國)中，輕柔吹吸消化顆粒細(xì)胞，時間控制在60 s以內(nèi)。然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至G-IVF PLUS(Vitrolife，瑞典)，用內(nèi)徑140 μm的脫顆粒針(COOK，美國)剝?nèi)ヮw粒細(xì)胞。

4.ICSI授精：將卵母細(xì)胞和精子分別加入到蓋有礦物油(Vitrolife，瑞典)的G-MOPS PLUS(Vitrolife，瑞典)操作微滴中，應(yīng)用顯微操作系統(tǒng)(Nikon，日本)進行ICSI操作。用固定針(Sunlight，美國)固定卵子，使第一極體位于約12點的位置。用注射針(Sunlight，美國)選擇形態(tài)正常、活力好的精子在聚乙烯吡咯烷酮(Vitrolife，瑞典)中制動，然后注射針從3點鐘方向進針將精子注入卵母細(xì)胞。正常情況下穿刺針頭部過中線位置后緩慢回吸收胞漿至突然加速，提示卵細(xì)胞破膜。停止回吸收，將精子慢慢注入胞質(zhì)后，稍作停頓再緩慢退出注射針。而在脆性卵膜卵母細(xì)胞的注射過程中，卵細(xì)胞膜沒有彈性，ICSI針直接進入卵胞質(zhì)內(nèi)，將精子注入后未回吸胞質(zhì)直接退針。將注射后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至G-1 PLUS(Vitrolife，瑞典)微滴中培養(yǎng)。

5.胚胎培養(yǎng)和移植：授精后16～20 h，觀察是否出現(xiàn)原核(PN)及原核數(shù)，見到兩個原核(2PN)確定為正常受精。授精后第3天觀察胚胎發(fā)育情況并進行評分，評分方法參考我中心之前發(fā)表的文獻[3]。評分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎為可用胚胎，Ⅰ級和Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎。若有2 枚及以上優(yōu)質(zhì)胚胎時建議進行囊胚培養(yǎng)，將胚胎轉(zhuǎn)移至G-2 PLUS(Vitrolife，瑞典)微滴培養(yǎng)，并根據(jù)Gardner方法[4]對囊胚評分。在第3天或第5天選擇1～2 枚胚胎移植入子宮。移植當(dāng)日開始使用黃體酮肌肉注射或陰道栓劑進行黃體支持。

6.妊娠判斷：卵裂期胚胎移植后14 d測血HCG≥50 U/L、囊胚期胚胎移植后9 d測血HCG≥25 U/L確定為HCG陽性；移植后28 d經(jīng)陰道超聲見孕囊者定義為臨床妊娠；HCG陽性而宮內(nèi)外均未見孕囊者定義為生化妊娠。

7.評價指標(biāo)：成熟卵母細(xì)胞率=MⅡ卵母細(xì)胞總數(shù)/獲卵總數(shù)×100%；ICSI卵細(xì)胞退化率=退化卵細(xì)胞數(shù)/注射MⅡ卵母細(xì)胞總數(shù)×100%；正常受精率=正常受精卵數(shù)(2PN)/MⅡ卵子總數(shù)×100%；卵裂率=正常受精卵裂數(shù)/正常受精卵數(shù)目×100%；D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目/正常受精卵裂胚胎總數(shù)×100%；D3可用胚胎率=D3可用胚胎數(shù)目/正常受精卵裂胚胎總數(shù)×100%；囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚胚胎總數(shù)×100%；未成熟卵母細(xì)胞率=(第一次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞總數(shù)+生發(fā)泡期卵母細(xì)胞總數(shù))/獲卵數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

利用易侕統(tǒng)計軟件進行傾向值匹配(匹配容差為0.05，進行1∶2的匹配)，得出脆性卵膜組和對照組。采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)的比較方法采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用百分比表示，組間比較方法采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本資料

脆性卵膜組和對照組兩組患者在年齡、不孕年限、不孕類型、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、Gn總量、Gn總天數(shù)、HCG日激素水平(雌二醇、孕酮、促黃體生成素)、獲卵數(shù)目等方面均無顯著差異(P均>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本情況的比較[(-±s)，%]

二、受精和胚胎情況

脆性卵膜組的成熟卵細(xì)胞率、正常受精率、可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著低于對照組(P<0.05)，而卵細(xì)胞ICSI后發(fā)生卵細(xì)胞退化率顯著高于對照組(P<0.05)；兩組間卵裂率、囊胚形成率均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

為了進一步了解兩組患者每周期所獲卵中未成熟卵母細(xì)胞占比的差異，將未成熟卵母細(xì)胞率按照<25%，26%～50%之間和>50%進行具體分層，統(tǒng)計兩組之間各分層周期的占比情況。結(jié)果顯示，脆性卵膜組的未成熟卵母細(xì)胞率在0%～25%區(qū)間所占周期數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，而未成熟卵母細(xì)胞率為26%～50%和>50%兩個區(qū)間所占周期數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。

三、妊娠結(jié)局

脆性卵膜組和對照組間新鮮周期移植胚胎個數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度均無顯著差異(P>0.05)。脆性卵膜組的胚胎種植率、臨床妊娠率均低于對照組，但差異無顯著性(P>0.05)(表4)。

表2 兩組間獲卵以及胚胎質(zhì)量的比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 兩組間未成熟卵母細(xì)胞率的比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.05

表4 兩組新鮮周期移植妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

在觀察期間的4 254個ICSI治療周期中有4.6%的ICSI周期的卵母細(xì)胞在ICSI注射時表現(xiàn)為脆性卵膜。脆性卵膜卵母細(xì)胞ICSI后卵細(xì)胞退化率升高，受精能力和胚胎發(fā)育潛能明顯下降，但胚胎種植潛能與臨床妊娠結(jié)局與正常卵膜組相比雖略有下降，但無顯著差異(P>0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)脆性卵膜組患者同一周期促排卵所獲卵細(xì)胞中，未成熟卵母細(xì)胞數(shù)居多，推測脆性卵膜卵母細(xì)胞的存在可能與卵細(xì)胞的質(zhì)量以及成熟度相關(guān)。卵細(xì)胞的質(zhì)量與其生長的卵泡微環(huán)境關(guān)系密切，不同的卵泡可能有不同的血供和激素水平。因此，同一促排周期獲得的卵細(xì)胞會表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，包括卵膜的特性[5-6]。Palermo等[7]研究發(fā)現(xiàn)脆性卵膜組患者促性腺激素使用天數(shù)短于正常卵膜組，扳機日雌激素水平也低于正常卵膜組，并考慮脆性卵膜與構(gòu)成細(xì)胞膜的脂蛋白結(jié)構(gòu)異常相關(guān)，而這種異?？赡苁怯煽刂菩源倥怕哑陂g卵泡激素環(huán)境改變引起的。Rosen等[5]的研究發(fā)現(xiàn)ICSI后卵細(xì)胞退化率高的患者基礎(chǔ)雌激素和扳機日雌激素水平都較低。但也有文獻報道HCG日高的雌激素水平可能會增加脆性卵膜卵母細(xì)胞出現(xiàn)的概率[2]。在本研究中，脆性卵膜卵母細(xì)胞組與對照組患者無論是在基礎(chǔ)FSH水平還是扳機日激素水平都沒有明顯差異。所以脆性卵膜卵母細(xì)胞可能受多種因素的影響，激素影響也許只是其中的一部分因素，具體機制還需要進一步的研究。

受精前成熟卵母細(xì)胞停滯在第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)，卵母細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核同步發(fā)育成熟，才具有良好的受精和胚胎發(fā)育潛能。ICSI注射前通過剝除顆粒細(xì)胞后觀察卵母細(xì)胞的第一極體排出情況判斷卵母細(xì)胞的成熟度，并以MⅡ卵率作為評估卵細(xì)胞成熟度指標(biāo)之一，用于預(yù)測ICSI受精率和胚胎發(fā)育潛能[8-9]。有研究表明卵細(xì)胞的成熟度不足會抑制皮質(zhì)顆粒的釋放，導(dǎo)致透明帶硬化并影響之后的受精過程[10]。Halvaei等[6]的數(shù)據(jù)顯示在每個取卵周期中仍有15%的卵細(xì)胞處于未成熟的狀態(tài)，且未成熟卵細(xì)胞的數(shù)量對受精結(jié)局具有預(yù)測作用，當(dāng)未成熟卵母細(xì)胞數(shù)≥2個時，受精率明顯下降。本研究中脆性卵膜細(xì)胞組的未成熟卵母細(xì)胞率顯著高于對照組且受精率顯著低于對照組的結(jié)果與之相似。Parrella等[11]的研究數(shù)據(jù)顯示ICSI周期未成熟卵母細(xì)胞率升高，卵子退化率會增加，受精能力和胚胎發(fā)育潛能下降。而本研究中脆性卵膜組卵母細(xì)胞ICSI后退化率也顯著升高，提示卵母細(xì)胞成熟度與卵膜的脆性可能相關(guān)。

ICSI是一種侵襲性操作，ICSI針機械地穿過卵母細(xì)胞的透明帶與細(xì)胞膜可能會破壞線粒體、微管、紡錘體等細(xì)胞器的分布，甚至損傷細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器。正常的卵細(xì)胞膜具有一定的張力，注射針穿刺到卵細(xì)胞膜時會形成一個漏斗狀的形態(tài)，輕微回吸收少許胞質(zhì)卵膜即穿破，退針過程中卵細(xì)胞膜緩慢恢復(fù)正常形態(tài)，確保了細(xì)胞膜的完整性，避免了微管、線粒體等細(xì)胞器的損傷。在小鼠卵母細(xì)胞注射實驗中已證實了卵膜凹陷成漏斗狀，對于卵細(xì)胞具有保護作用，可避免卵細(xì)胞在注射后發(fā)生退化[12]。在本研究中，脆性卵膜細(xì)胞組ICSI后卵細(xì)胞退化率高于對照組，受精率低于對照組，這個結(jié)果與之前的研究一致[2，13]。這可能是因為ICSI針直接穿破卵細(xì)胞膜，脆性卵膜卵母細(xì)胞缺乏漏斗狀的保護作用，從而破壞了細(xì)胞骨架的完整性，最終導(dǎo)致卵細(xì)胞發(fā)生退化[2，7]。

在本研究中，脆性卵膜組與對照組在囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率等方面均無顯著性差異(P>0.05)。提示我們盡管脆性卵膜卵母細(xì)胞ICSI后容易發(fā)生退化，但如果脆性卵膜卵母細(xì)胞能夠正常受精，則與正常卵母細(xì)胞有著相同的種植潛能。Mizobe等[2]研究也發(fā)現(xiàn)脆性卵膜卵母細(xì)胞來源的胚胎與正常卵母細(xì)胞來源的胚胎有相同的種植潛能，而且同一患者促排卵所收獲的同胞卵中既有正常的卵母細(xì)胞又有脆性卵膜卵母細(xì)胞的存在，但脆性卵膜卵母細(xì)胞的存在并不影響其余正常卵細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育。Abdelmassih等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在前次周期里表現(xiàn)為脆性卵膜的患者在下次ICSI周期中仍有部分卵母細(xì)胞表現(xiàn)為脆性卵膜，且在ICSI后表現(xiàn)為較高的退化率。因此，如何避免ICSI時脆性卵膜卵母細(xì)胞的退化對改善結(jié)局至關(guān)重要。Palermo等[7]通過改善注射方式對透明帶進行切線穿透，溫和地穿透卵膜，在一定程度上可以形成漏斗，保護卵母細(xì)胞骨架。Abdelmassih等[14]在研究中對于既往有脆性卵膜卵細(xì)胞的患者進入到下一周期，將同一患者所收獲的卵細(xì)胞隨機分組，一組在進針前通過激光將透明帶穿透或削薄，另一組使用傳統(tǒng)ICSI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)激光穿孔可以降低ICSI時卵細(xì)胞退化率。還有報道發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的ICSI相比，Piezo-ICSI(超音振動顯微受精法)可以提高ICSI后卵母細(xì)胞的存活率和受精率[15-16]。所以對于脆性卵膜卵母細(xì)胞采用激光輔助的ICSI或Piezo-ICSI可能是一個較好的選擇。

本研究也有一些不足之處，ICSI操作為多人完成，都是主觀評估卵膜的韌性，加之操作過程中人員之間有微小的差異，難免對結(jié)果造成偏倚；沒有針對發(fā)生脆性破膜細(xì)胞數(shù)量具體分組，來觀察部分脆性破膜與全部脆性破膜周期的妊娠結(jié)局間的差異；未對脆性卵膜組人群進行進一步分析，如卵泡液的激素水平分析及患者的基因水平的檢測等。未來可以在這些方面進一步研究。

既往關(guān)于脆性卵膜卵母細(xì)胞的形成機制尚不清楚，本文研究結(jié)果顯示其可能與卵母細(xì)胞成熟度及質(zhì)量較差相關(guān)。ICSI后部分卵細(xì)胞發(fā)生退化，導(dǎo)致脆性卵膜組的受精率、可用胚胎率等顯著低于對照組，但最終妊娠結(jié)局與對照組相比沒有顯著差異。提示在臨床工作中對于脆性卵膜組的患者進入下一次IVF周期時，可以根據(jù)卵泡生長發(fā)育與激素水平變化，調(diào)整促排卵以及板機藥物的用量，在保證卵泡大小均勻的情況下，盡量推遲扳機時間，以提高卵母細(xì)胞成熟度。實驗室人員可以具體測量卵泡液激素水平間的差異，對脆性卵膜卵母細(xì)胞嘗試延遲注射時間，注射過程中應(yīng)盡可能地輕柔操作，從而進一步減少卵細(xì)胞注射后退化情況的發(fā)生，并將胚胎放入Time-lapse中動態(tài)觀察胚胎發(fā)育情況，選擇合適的時間將胚胎移植回宮腔或冷凍保存。未來需要積累更多的脆性卵膜卵母細(xì)胞方面的數(shù)據(jù)來進一步分析研究。