脂脈寧對(duì)酒精性脂肪肝大鼠血清 TNF-α和 IL-8的影響*

河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院 解慶凡 王建華 張一昕 王曉貞 郭文平 （邢臺(tái) 054031）

脂脈寧為課題組在長期臨床實(shí)踐過程中自行研制的治療酒精性脂肪肝 （AFL）的有效中藥制劑,經(jīng)多年臨床運(yùn)用證實(shí),療效確切。[1]據(jù)報(bào)道,細(xì)胞因子的啟動(dòng)和致敏是脂肪肝肝損害中的關(guān)鍵一步。[2]為了探討脂脈寧的作用機(jī)理,筆者觀察了其對(duì) AFL模型大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康 wistar大鼠 70只,♂,清潔級(jí),體重160～180 g,購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （合格證號(hào):1003046）。

1.2 藥物 脂脈寧組成:澤瀉、姜黃、山楂、石菖蒲、皂角、大黃、何首烏等。由我院制劑室制成膠囊制劑,實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度。東寶肝泰片:通化東寶藥業(yè)股份有限公司出品,批號(hào)為 H 22024764。實(shí)驗(yàn)時(shí)用 0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。

1.3 試劑來源 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、總膽固醇 （TC）、甘油三酯 （TG）試劑盒均由北京中生生物工程高技術(shù)公司提供,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素 8（IL-8）放免試劑盒均購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所,膽固醇、膽鹽均購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司,56度紅星二鍋頭白酒 （北京紅星二鍋頭酒廠生產(chǎn)）。

1.4 主要儀器 半自動(dòng)生化分析儀 （德國毫邁克公司）、FJ-2020型 γ射線免疫計(jì)數(shù)器 （國營 262廠）、MSE-25型高速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將 70只健康雄性 wistar大鼠,飼養(yǎng)于18℃～22℃明暗各 12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi),正常喂養(yǎng)1周后,按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,即:正常對(duì)照組 （簡稱正常組）、模型對(duì)照組 （簡稱模型組）、脂脈寧高、低劑量組（簡稱高、低劑量組）、東寶肝泰對(duì)照組（簡稱對(duì)照組）。除正常組 10只外,其余各組均為 15只。

2.2 造模與給藥 正常組用蒸餾水灌胃,進(jìn)食普通飼料,自由飲水。其余各組參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]加以改良,用56%紅星二鍋頭灌胃,濃度從 30%逐漸升至 56%,梯度為每周升高 5%,于第 6周直接升至 56%,并持續(xù)至第 8周,同時(shí)喂飼高脂飼料 （由 1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和 88%基礎(chǔ)飼料制成）,自由飲水。大鼠造模的同時(shí)給藥治療,正常組和模型組給予蒸餾水灌胃,脂脈寧高、低劑量組和對(duì)照組分別給予相應(yīng)藥物灌胃。1次/d,每次用藥體積均按 1mL/100 g計(jì)算,持續(xù) 8周。

2.3 標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)8周末,于最后 1次給藥后禁食 12 h麻醉狀態(tài)下取血,將血樣低溫離心,分離血清,密封,-20℃冷存待檢。取血后迅速剖取肝臟,在肝臟最大葉距邊緣 0.5 cm處取 0.5×0.5 cm大小肝組織,用 4%的多聚甲醛固定。另取適量肝組織用冰生理鹽水沖洗,濾紙吸濕后,稱取濕重 0.3 g左右,加入預(yù)冷的生理鹽水,冰水中制成 10%勻漿,4℃4 000 r/min離心 10m in,提取上清液,-20℃冷存待檢。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察:取用 4%的多聚甲醛固定肝組織,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4.2 血脂和肝功能檢測:取血清在半自動(dòng)生化分析儀上測定 TC、TG、AST、ALT

2.4.3 血清TNF-α和 IL-8的測定:采用放射免疫法,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色后光鏡下觀察:正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈大而壁薄,肝細(xì)胞排列成肝索,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,細(xì)胞呈多邊形,無濁腫、壞死,胞漿無脂滴,無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清,肝細(xì)胞索紊亂,肝竇變窄,多數(shù)肝細(xì)胞濁腫、明顯脂肪變性,脂滴以大泡型為主,可見點(diǎn)狀壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。各治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞脂肪變性明顯好轉(zhuǎn),肝細(xì)胞排列整齊,肝竇基本恢復(fù)正常,少量肝細(xì)胞濁腫,無炎細(xì)胞浸潤和壞死。

3.2 脂脈寧對(duì) AFL大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量異常升高 （P＜0.01）,顯示 AFL大鼠存在著明顯的血脂代謝紊亂和肝功能異常。給藥后,脂脈寧高、低劑量組和對(duì)照組均能顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量,與模型組比較差異均具有顯著性 （P＜0.05或 P＜0.01）。其中,高劑量組明顯優(yōu)于對(duì)照組 （P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果詳見表 1。

表1 各組大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的變化情況 （±s）

表1 各組大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的變化情況 （±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01,**P＜0.05;與對(duì)照組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 TG（mmol/L） TC（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L）正常組 0.78±0.11* 1.47±0.16* 56.51±7.68* 81.33±9.59*模型組 1.69±0.16 3.65±0.32 125.36±13.93 207.52±15.82高劑量組 0.81±0.13*△△ 1.63±0.21*△ 44.27±6.38*△ 104.71±9.28*△△低劑量組 0.96±0.12* 1.65±0.26*△ 52.38±5.83* 130.73±11.02*對(duì)照組 1.02±0.17* 1.98±0.25* 57.62±8.01* 136.56±10.48*

3.3 脂脈寧膠囊對(duì) AFL大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清 TNF-α和IL-8的含量均較正常組異常升高 （P＜0.01）;給藥后各治療組大鼠血清 TNF-α和 IL-8的含量均低于模型組 （P＜0.01）;其中,高、低劑量組血清TNF-α含量均低于對(duì)照組;高劑量組血清 IL-8含量低于低劑量組和對(duì)照組 （P＜0.05）。結(jié)果詳見表 2。

表2 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比較 （±s）

表2 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比較 （±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01;與對(duì)照組比較,△P＜0.05;與高劑量組比較,▲P＜0.05

分組 TNF-α（ng/mL） IL-8（pg/mL）正常組 0.93±0.15* 195.78±15.34*模型組 1.76±0.26 268.76±26.15高劑量組 1.09±0.23*△ 130.81±11.55*△低劑量組 1.13±0.18*△ 179.46±21.66*▲對(duì)照組 1.39±0.21* 186.82±19.31*

4 討論

AFL在中醫(yī)學(xué)中無獨(dú)立的病名,根據(jù)其病因、病機(jī)及臨床表現(xiàn),可歸屬于中醫(yī)學(xué)的 “酒疸、脅痛、傷酒、酒癖、酒脹、酒勞、積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為酒為濕熱有毒之邪氣,味甘、苦、辛,性溫,有毒;歸心、肝、脾、胃經(jīng)。過量飲用則酒毒濕熱蘊(yùn)結(jié)于中焦,損傷脾胃,濕濁內(nèi)生,聚濕生痰,痰阻氣滯,肝失疏泄,氣滯血瘀,痰濕瘀毒相搏,結(jié)于脅下而成此病。病情纏綿不愈,日久則耗傷肝腎之陰。因此濕熱痰瘀互結(jié),肝脾失調(diào)為 AFL的主要病機(jī),故脂脈寧選用澤瀉利濕消痰、泄熱;皂角祛痰散結(jié);姜黃、山楂疏肝行氣、祛瘀通絡(luò);石菖蒲、白術(shù)祛濕健脾;大黃通腑導(dǎo)滯,排除濕毒瘀積;何首烏補(bǔ)肝腎、益精血。諸藥合用,共奏除濕泄熱、疏肝活血、健脾益腎之功。

肝臟是人體的重要解毒器官,酒精的解毒代謝過程主要在肝臟中進(jìn)行,長期大量攝入酒精性飲品,酒精代謝產(chǎn)物直接刺激肌體產(chǎn)生內(nèi)毒素,肝內(nèi)蓄積的酒精及其氧化代謝產(chǎn)物可直接刺激肌體產(chǎn)生內(nèi)毒素。血中內(nèi)毒素升高,刺激激活肝臟 Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生大量核轉(zhuǎn)錄因子,如 NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素 E2（PGE2）等。NF-κB誘導(dǎo)激活肝臟 Kupffer細(xì)胞,釋放大量IL-6、IL-8等炎癥因子。TNF-α可直接引起肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥及肝細(xì)胞壞死。[2]IL-8為中性粒細(xì)胞活化及趨化性刺激因子,可促使炎癥細(xì)胞,如活化的中性粒細(xì)胞聚集至肝臟,引起炎癥。TNF-α還可以誘導(dǎo) IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的釋放,促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤,并通過脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞受損,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。酒精性肝病患者血清 IL-8濃度與肝臟內(nèi)浸潤中性粒細(xì)胞的數(shù)目密切相關(guān),臨床研究表明,ALD病人血清中 IL-8水平明顯高于正常人。[5-6]本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA、TNF-α和 IL-8的含量明顯升高,鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞索紊亂,肝細(xì)胞呈大泡樣脂肪變性,并可見壞死灶和炎癥細(xì)胞浸潤。經(jīng)過藥物治療后,血清中 TC、TG、AST、ALT、TNF-α和 IL-8的含量明顯降低,肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善。這種抑制細(xì)胞因子的分泌和釋放,調(diào)節(jié)免疫的作用,可能是脂脈寧治療AFL的作用機(jī)制之一。

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（2010-11-18 收稿）