Twist和基質(zhì)金屬蛋白酶 -2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)分析

裴素霞,齊貴勝

研究顯示,轉(zhuǎn)錄因子 Twist、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-2通過(guò)不同的途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用[1-2]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2的表達(dá),探討兩者在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 聊城市人民醫(yī)院病理科存檔的 2008年 1月—2009年 12月外檢乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本蠟塊 68例 (患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及激素治療),均為女性病例,年齡32～75歲,平均 51.04歲?；颊吣挲g≤50歲者 31例, ＞50歲者 37例;腫塊直徑≤2 cm者 32例,2～5 cm者 20例,≥5 cm者 16例;伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 31例,無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例;根據(jù) Elson and Ellis半定量分級(jí)法進(jìn)行組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí) 23例,Ⅱ級(jí) 32例,Ⅲ級(jí) 13例。20例乳腺良性病變 (乳腺纖維腺瘤)為對(duì)照組。病理診斷經(jīng)兩位病理學(xué)專(zhuān)家復(fù)核證實(shí)。

1.2 試劑 Twist鼠抗人單克隆抗體為 Santa Cruz公司產(chǎn)品(工作濃度為 1:200);鼠抗人 MMP-2單克隆抗體 (即用型),免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司,操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 方法 所有標(biāo)本均經(jīng) 10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋。將每一例蠟塊作 4μm厚的連續(xù)切片,免疫組化采用 Elivision Plus法檢測(cè)標(biāo)本組織中的 Twist和 MMP-2表達(dá)。用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Twist、MMP-2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。參照文獻(xiàn) [3-4]以半定量判斷 Twist、MMP-2免疫組化結(jié)果:光鏡下隨機(jī)觀(guān)察免疫組化染色切片 5個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野分別計(jì)算 200個(gè)細(xì)胞,共計(jì)數(shù) 1 000個(gè)細(xì)胞。從兩方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)分:按陽(yáng)性著色程度評(píng)分,0分為無(wú)著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分:0分為陰性;1分為 ＜10%;2分為 11% ～50%;3分為 51%～75%;4分為 ＞75%。以?xún)烧叱朔e判定結(jié)果:4～l2分定為陽(yáng)性,4分以下定為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較采用 χ2檢驗(yàn);Twist、MMP-2表達(dá)的相關(guān)分析采用非參數(shù)相關(guān)性 Spearman檢驗(yàn),顯著性水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá)比較 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為 55.88%、73.53%,明顯高于其在乳腺纖維腺瘤中陽(yáng)性表達(dá)率 15%、35%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為 10.380和 10.055,P＜0.01,見(jiàn)表 1)。

表1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及乳腺纖維腺瘤組織中 Twist和MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)Table 1 The positive expression of Twist and MMP-2 in IDCand fibroadenoma

2.2 Twist、MMP-2表達(dá)水平與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系 腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移、不同組織學(xué)分級(jí)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織 Twist陽(yáng)性表達(dá)率和 MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);不同年齡患者、不同直徑腫瘤乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2陽(yáng)性率間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見(jiàn)表 2)。

表2 不同臨床病理指標(biāo)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2陽(yáng)性率表達(dá)比較Table 2 Comparison of the positive expression rates of Twist and MMP-2 in IDCwith different clinical-pathological features

2.3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2表達(dá)的相關(guān)性68例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist和 MMP-2同時(shí)陽(yáng)性表達(dá) 32例,占 47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同時(shí)陰性表達(dá) 12例,占 17.65%(12/68)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué) Spearman檢驗(yàn),Twist表達(dá)與 MMP-2表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.272,P＜0.05,見(jiàn)表3)。

3 討論

Twist作為果蠅、鼠、人等生物體內(nèi)的一種堿性螺旋一環(huán)一螺旋轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育階段誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的調(diào)控過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn) Twist具有癌基因的特征,能編碼凋亡抑制蛋白,通過(guò)作用于 p53依賴(lài)性和非依賴(lài)性通路、N-Myc通路以及 NF-KB通路發(fā)揮抗凋亡作用[5-7],Twist還可通過(guò)對(duì) Akt途徑的正性調(diào)控作用抑制凋亡[8];Twist在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)影響 E-box啟動(dòng)子的表達(dá),誘導(dǎo)上皮細(xì)胞 -間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)變 (EMT)的形成[9],從而抑制 E-cadherin轉(zhuǎn)錄,使由 E-cadherin所調(diào)控的細(xì)胞粘附作用失效,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶上脫落,侵入周?chē)M織[10];Twist上調(diào)可增強(qiáng) VEGF表達(dá),促進(jìn)血管生成,并提高染色體的不穩(wěn)定性,促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。Yang等[12]用裸鼠的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌模型顯示,Twist高表達(dá)的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞系易發(fā)生轉(zhuǎn)移,Twist對(duì)癌細(xì)胞的血管內(nèi)滲和肺轉(zhuǎn)移起重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist的陽(yáng)性表達(dá)率為 56%,明顯高于對(duì)照組的 15%;Twist的陽(yáng)性表達(dá)與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)有關(guān),發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)較高的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高,與蔡鳳林等[13]研究結(jié)果一致,提示 Twist參與了乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生、發(fā)展。

表3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2表達(dá)相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of Twist and MMP-2 in IDC

細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜的破壞是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件,其中 MMPs與腫瘤關(guān)系最為密切。MMPs是一組依賴(lài)于鋅離子的能降解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶家族,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。MMP-2是金屬蛋白酶家族中與腫瘤關(guān)系最為密切的因子之一。MMP-2是一種鋅離子依賴(lài)的蛋白水解酶,由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞以酶原形式分泌,經(jīng)水解后激活,能特異性地降解基底膜的主要成分:Ⅳ型膠原,還可降解 V、Ⅵ、X型膠原、FN和明膠,同時(shí)通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。Tester等[15]通過(guò)基因轉(zhuǎn)染,將 pro-MMP-2基因轉(zhuǎn)入人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 MDA-MB-231細(xì)胞株中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后的腫瘤細(xì)胞侵襲能力明顯增加。馮悅年[16]采用免疫組化 SP法檢測(cè) 65例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 MMP-2的表達(dá),結(jié)果顯示:MMP-2表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與患者年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān),MMP-2高表達(dá)者生存率明顯降低。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)率為 74%,明顯高于對(duì)照組 35%。MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)有關(guān),與患者年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān),與文獻(xiàn)報(bào)道相似[17],說(shuō)明 MMP-2參與了乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,并與腫瘤的惡性程度相關(guān)。

顧紀(jì)明等[18]研究 48例結(jié)直腸癌組織中的 Twist和 MMP-2的表達(dá),結(jié)果標(biāo)明 Twist和 MMP-2的表達(dá)有關(guān)。楊靜等[19]采用 RNA干擾技術(shù)在小鼠乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞株 4T1中沉默 Twist的表達(dá),通過(guò)全基因組基因芯片技術(shù)檢測(cè)了 Twist沉默前后 4T1細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異性,結(jié)果顯示 Timp-2(MMP2的抑制劑)被上調(diào),認(rèn)為在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)展中,Twist很可能通過(guò)調(diào)節(jié) MMP-2來(lái)降解在侵襲和轉(zhuǎn)移中遇到的一系列組織屏障從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究 68例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Twist和 MMP-2同時(shí)陽(yáng)性表達(dá) 32例,占47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同時(shí)陰性表達(dá) 12例,占17.65%(12/68),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Twist表達(dá)與 MMP-2表達(dá)呈正相關(guān),提示 Twist、MMP-2共同參與了乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,Twist可能通過(guò)上調(diào) MMP-2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解,成為其促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的因素之一。

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