三硝基甲苯對(duì)斑馬魚半致死濃度和致畸率的測定

謝 松,王 佳,葉正芳,盧勝濤,郭 華

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071002;2.北京大學(xué)環(huán)境技術(shù)研究中心,北京100871;3.河北大學(xué) 圖書館,河北 保定 071002)

1 引言

2,4,6-三硝基甲苯(TNT)是一種軍事和民用廣泛應(yīng)用的含能材料,用量居首位[1],具有高毒性和致變性,它可通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及皮膚而進(jìn)入生物體內(nèi),導(dǎo)致血相改變、紫紺、白內(nèi)障、正鐵血紅蛋白血癥和中毒性肝炎等。由于土壤對(duì) TNT有很強(qiáng)的吸附作用,因而如果廢水中的 TNT不經(jīng)過處理直接排放,TNT就會(huì)很快滲入地下,積存于土壤中,將嚴(yán)重危害環(huán)境,TNT對(duì)水體和土壤環(huán)境的污染早已受到重視。由于TNT廢水的化學(xué)穩(wěn)定性及生物毒性,單獨(dú)使用一項(xiàng)技術(shù)處理該廢水,很難達(dá)有效的控制 TNT的含量[2～5]。

斑馬魚(Danio rerio,俗稱zebra fish)是常見的暖水性(21～32 ℃)觀賞魚,鯉科,個(gè)體小(4～5cm),是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物之一,其作為生態(tài)毒理學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理試驗(yàn)研究中[6～7]。斑馬魚作為模式生物,可以通過檢測乙酰膽堿酯酶的活性、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性、P450酶系(屬于單加氧酶(monooxygenase),又稱為多功能氧化酶(m ixed function oxidase)、羥化酶(hydroxy lase),因其還原態(tài)的吸收峰在450nm處,故名。)7-乙氧基-3-異吩唑酮-脫乙基酶(EROD)的活性進(jìn)一步分析不同濃度的有毒物質(zhì)的不同代謝反應(yīng),從而為廢水處理提供有利的數(shù)據(jù)參考[8～10]。

目前,斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)是監(jiān)測工業(yè)污染及污水檢測的重要手段之一[11]。隨著發(fā)育生物學(xué)和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展,應(yīng)用斑馬魚胚胎來研究污染物的致毒機(jī)理將成為生態(tài)研究中的重要手段。斑馬魚胚胎發(fā)育直至孵化的72h內(nèi)可以觀察到近20種不同表現(xiàn)的反應(yīng)指標(biāo),見表1[12]。

表1 可以觀察的毒理學(xué)終點(diǎn)

鑒于胚胎毒性測試對(duì)于絕大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的敏感度高于成魚急性毒性實(shí)驗(yàn),經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)在1998年將上述方法列入測定單一化學(xué)品毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一,并制定了詳細(xì)的操作指南(OECD TG212)[13]。現(xiàn)在,這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境有毒物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)乃至人類安全的評(píng)估中。隨著中國經(jīng)濟(jì)和國防事業(yè)的飛速發(fā)展,爆破器材的研發(fā)和應(yīng)用,使得三硝基甲苯,對(duì)河流和空氣造成了一定的污染。本試驗(yàn)通過不同濃度的三硝基甲苯溶液對(duì)斑馬魚的致死程度不同來計(jì)算其半致死濃度。在污水處理方面有重要作用。

2 材料和方法

試驗(yàn)容器選用1L燒杯、試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣的自來水、試驗(yàn)魚苗購于河北省保定市花鳥魚蟲市場、三硝基甲苯購于試劑公司。

2.1 TNT濃度測定

由于TNT屬于難溶于水,所以不能保證所加TNT粉末在短時(shí)間內(nèi)完全溶于水,這對(duì)試驗(yàn)的進(jìn)度和準(zhǔn)確度造成了影響,于是采用配置高濃度 TNT溶液,使用時(shí)再稀釋的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.1 TNT溶液配制

取30mgTNT粉末置于500m L蒸餾水中,25℃水浴中放置一周左右,期間隨時(shí)晃動(dòng),待用是將未溶的TNT過濾,得到高濃度 TNT溶液母液,備用。再通過亞硫酸鈉-氯化十四烷基吡啶分光光度法測定溶液中TNT的含量。

2.1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6個(gè)25m L的容量瓶,分別加入10mg?L-1TNT 標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5 、1、3 、5、7 、10m L,依次加入 10%亞硫酸鈉溶液2m L,0.5%氯化十四烷基吡啶溶液2m L,然后稀釋到刻度,混勻后用2cm比色皿,以蒸餾水作為空白參比,在466nm波長處,測量吸光度。繪制出測定TNT的標(biāo)準(zhǔn)曲線,當(dāng)25m L溶液中含有TNT0～100μg時(shí),符合比爾定律,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于 0.999[14～16],見圖1。

圖1 TNT標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 自制TNT溶液濃度測定

通過分光光度計(jì)測量吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比,測的1m L自制 TNT溶液中 TNT含量為45.017μg。

2.2 試驗(yàn)魚處理

將新購買回的魚苗正常喂養(yǎng)一周以上,每天上午換水,早晚喂食各一次,水溫保持在27℃左右。喂養(yǎng)期間無死亡現(xiàn)象,表明魚苗無疾病隱患。試驗(yàn)正式開始前1d停止喂食,期間無魚苗死亡,符合試驗(yàn)魚要求。

2.3 試驗(yàn)步驟

正式的試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)濃度組,3個(gè)平行,其中有1個(gè)為空白對(duì)照組,5個(gè)試驗(yàn)組。試驗(yàn)組TNT含量分別為(TNT溶液母液的濃度為 45.017μg?m L-1)。設(shè)置對(duì)照組為 0μg? L-1(45.017μg?m L-1×0m L);濃度 1為 2 250.85μg?L-1(45.017μg?m L-1×50m L);濃度 2 為 3 151.19μg?L-1(45.017μg?m L-1×70m L);濃度 3為 4 051.53μg?L-1(45.017μg?m L-1×90m L);濃度 4為4 951.87μg?L-1(45.017μg ?m L-1×110m L);濃度5為 5 852.21μg? L-1(45.017μg? m L-1×130m L)。

將配置好的TNT溶液加入燒杯中混勻,再隨機(jī)加入10條魚苗,24 h后對(duì)死亡魚苗進(jìn)行計(jì)數(shù),用針刺魚苗不活動(dòng)的為死亡。

2.4 孵化致畸試驗(yàn)

將所購買的魚苗,雌雄分開飼養(yǎng),每天2次喂魚,水溫保持在28±1℃。光周期為 14(亮)：10(暗)。待孵化試驗(yàn)的前一天選取體型健康游動(dòng)活潑的雄魚5條和腹部有明顯隆起的雌魚3條,放于同一魚缸中同時(shí)用隔板隔離,過夜,于次日早晨取出隔板,約1～2h后,去觀察是否有魚卵并收集于培養(yǎng)皿中沖洗干凈。選取透明有雙層膜的魚卵進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

TNT的濃度梯度分為以下5個(gè)：(TNT溶液母液的濃度為 23.194μg?m L-1);對(duì)照組為 0μg?L-1(23.194μg?m L-1×0m L);濃度1為 463.88μg?L-1(23.194μg?m L-1×20m L);濃度2為 927.76μg?L-1(23.194μg?m L-1×40m L);濃度3為1 855.52μg?L-1(23.194μg?m L-1×80m L);濃度 4為3 711.04μg?L-1(23.194μg?m L-1×160m L)。每組有3個(gè)平行,每組50枚魚卵。魚卵大約72h天后孵化成功。每天記錄1次魚卵發(fā)育過程中的致畸和死亡情況。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TNT對(duì)成魚致死的情況如圖2所示。

圖2 tn t對(duì)成魚致死的情況

24h半致死濃度(LC50)根據(jù)圖2可得24h半致死濃度即LC50=3 711.33μg?L-1。孵化率和致畸情況如表3所示。

表3 不同濃度TNT 72h孵化率和致畸情況

3 結(jié)語

根據(jù)對(duì)24 h內(nèi)未死的魚苗進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)處理的第1個(gè)24h非常關(guān)鍵,在第1個(gè)24h未死的魚苗,后續(xù)時(shí)間內(nèi)死亡率會(huì)大幅度降低的情況,具體適應(yīng)機(jī)理還不明確,仍需要從體內(nèi)各種酶變化情況進(jìn)行進(jìn)一步研究。致畸率的結(jié)果表明三硝基甲苯能抑制斑馬魚胚胎的發(fā)育,高濃度三硝基甲苯還能引起斑馬魚幼苗畸形。由胚胎的孵化率和魚苗的畸形率可以看出三硝基甲苯對(duì)胚胎的影響隨其濃度的增高而突然加大,在三硝基甲苯濃度為463.88μg?L-1以下時(shí),胚胎的孵化率和畸形率上升較慢,濃度在463.88μg?L-1到 927.76μg?L-1之間時(shí),平均孵化率下降15%,畸形率增加將近一倍,而濃度大于927.76μg?L-1小于 1855.52μg?L-1時(shí),孵化率下降32%,畸形率增加 6倍,濃度達(dá)到 1855.52μg?L-1時(shí),孵化率不到一半,畸形率達(dá)到90%以上,當(dāng)濃度達(dá)到3711.04μg?L-1時(shí)胚胎出現(xiàn)全致死效應(yīng)。這表明高濃度的TNT(大于927.76μg?L-1)對(duì)胚胎發(fā)育毒性極大。研究表明,胚胎的毒性測試對(duì)于絕大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的敏感度高于成魚毒性實(shí)驗(yàn)[12],實(shí)驗(yàn)也證明了三硝基甲苯對(duì)胚胎的發(fā)育的影響較成魚更為顯著。

中國(GB4274-84)梯恩梯工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn) 0.5～30.0mg?L-1(總硝基化合物,以2,4-DNT和α-DNT計(jì))。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本屬于排放標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi),但是如果按照標(biāo)準(zhǔn)的最高值排放,將對(duì)環(huán)境生物產(chǎn)生不可恢復(fù)性的影響,所以筆者認(rèn)為中國梯恩梯工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)上線過高,應(yīng)對(duì)污染物的排放量進(jìn)行更準(zhǔn)確的規(guī)定。

致謝：感謝北京大學(xué)葉正芳教授對(duì)本文的指導(dǎo)。

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