遠志對 A β 25-35誘導 AD模型大鼠海馬區(qū) NF-κ B活化研究

黃作義,許志剛,吳成吉,張曉梅,朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是發(fā)生于老年和老年前期,以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,是老年期癡呆的最常見類型,約占老年期癡呆的50%。臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算能力損害、人格和行為的改變等。截止 2006年,全球癡呆患者約有 2430萬(我國 500萬 ),每年新發(fā)病例460萬(我國 30萬),且每年翻一番。各國調(diào)查趨勢匯總顯示,癡呆患病率在 2%～ 7%,女性多于男性[1]。N F-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)可將信息從胞漿傳至細胞核并引起相應基因表達的重要轉錄因子,活化后可調(diào)控眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達,調(diào)節(jié)免疫反應,參與細胞內(nèi)信號傳遞。遠志是著名的益智藥物,遠志藥草的命名就集中地體現(xiàn)了益智強記的主要功能,始載《神農(nóng)本草經(jīng)》,至今,中醫(yī)臨床實踐已近兩千年。本實驗以海馬區(qū)注射 A β25-35建立的 AD模型大鼠為研究對象,從 NF-κB活化角度探討遠志對 AD的防治作用。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級 Wistar大鼠 96只 ,雄性 ,體重 250～ 300g,由佳木斯大學醫(yī)學實驗動物中心提供,標準鼠飼料飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

遠志:由哈爾濱三九藥業(yè)生產(chǎn),1g相當于6g飲片。

1.3 主要試劑

A β 25-35(武漢博士德生物工程有限公司),NF-κBp65激活-核轉運試劑盒 (碧云天生物技術研究所),兔抗大鼠 P-I κ B α抗體 (上海迪奧生物技術有限公司),兔抗大鼠 IκB α、SABC免疫組化檢測試劑盒、DAB染色試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

單臂腦立體定位儀(M P8000)(深圳瑞沃德生命科技有限公司);Morris水迷宮 (成都泰盟科技有限公司);熒光倒置顯微鏡(IBE2000)(重慶光電儀器有限公司)。

2 方法及檢測指標

2.1 動物分組

將96只大鼠隨機分為正常對照組,假手術組,模型組 ,遠志低、中、高劑量組共6組,每組16只。

2.2 AD動物模型制備

將 A β 25-35肽段 lmg溶于0.5mL滅菌生理水中,濃度為 2 μg/μL,37℃恒溫孵育一周,使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的 A β,放置于4℃冰箱備用。模型組,遠志低、中、高劑量組以10%水合氯醛 (0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠;麻醉成功后,立體定位儀固定頭部,顱頂區(qū)備皮,常規(guī)消毒手術區(qū)皮膚。沿顱頂中線作 2cm切口,分離骨膜使頭骨暴露,參照《大鼠腦立體定位圖譜》,海馬區(qū)定位坐標:于前囟向后3.0mm,中線左右各旁開2.0mm,用牙科鉆鉆開顱骨 ,垂直進微量進樣器針2.8mm,將5μL溶液緩慢注入,留針5min,以保證溶液充分彌散,然后緩慢撤針,縫合切口皮膚,青霉素肌注8萬單位 /次,連續(xù)肌注3d,假手術組手術方法相同,注射同體積的生理鹽水。

2.3 給藥方法

用開水按比例稀釋成0.083g/mL,0.167g/mL,0.334g/mL低中高三個劑量組,4℃保存。各組大鼠均按1mL/100g·d。A β注射后第 7天開始灌胃給藥 ,連續(xù) 4周。

2.4 各組大鼠海馬區(qū) NF-κB p65的活化

制作腦冠狀石蠟切片,用免疫熒光法測定海馬區(qū) N F-κB p65核移位情況,所有操作嚴格按照碧云天生物技術研究所 N F-κ B激活-核轉運試劑盒說明書進行。

2.5 各組大鼠海馬區(qū) P- IκB α、 I κ B α的表達

免疫組化步驟(SABC法),按試劑盒說明書操作步驟進行。

2.6 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,以P＜0.05為顯著性差異水平。統(tǒng)計陽性細胞數(shù)的計算取每只大鼠腦組織切片3張,每張切片于海馬區(qū)隨機選取5個區(qū)域,在400×顯微鏡下計算此區(qū)域內(nèi)的免疫組化染色為陽性細胞數(shù),將所得均數(shù)作為每只動物的陽性細胞數(shù)作為統(tǒng)計資料,結果以 (±s)表示。

3 結果

3.1 海馬區(qū) NF-κB p65的活化

N F-κ B p65呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光 ,如細胞核內(nèi)出現(xiàn)粉色熒光則表示 N F-κ B進入核內(nèi)為陽性細胞。與正常對照組相比,假手術組中 N F-κ B蛋白陽性細胞數(shù)無顯著差異。與正常對照組和假手術組比較,其余各組 N F-κB蛋白陽性細胞數(shù)均顯著增加 (P＜0.05)。與模型組比較 ,遠志各劑量組中 NF-κB蛋白陽性細胞數(shù)均顯著減少(P ＜0.05)。與遠志低劑量組比較 ,遠志中、高劑量組中 NF-κB蛋白陽性細胞數(shù)均顯著減少 (P＜0.05)。與遠志中劑量組比較,遠志高劑量組中 N F-κ B蛋白陽性細胞數(shù)無顯著差異。

3.2 海馬區(qū) P- IκB的表達

P-I κ B陽性細胞定位于細胞漿,呈棕黃色。與正常對照組和假手術組相比,模型組、遠志低中劑量組 P-I κ B蛋白陽性細胞數(shù)均顯著增加 (P＜0.05),遠志高劑量組中 P- IκB蛋白陽性細胞數(shù)無顯著差異。與模型組相比,遠志低中高劑量組 P-I κ B蛋白陽性細胞數(shù)均顯著降低 (P ＜0.05)。

3.3 海馬區(qū) I κ B的表達

Iκ B陽性細胞定位于細胞漿,呈棕黃色。與正常對照組和假手術組相比,其余各組 Iκ B蛋白陽性細胞數(shù)均顯著降低(P ＜0.05)。與模型組相比,遠志低、中、高劑量組, Iκ B蛋白陽性細胞數(shù)逐漸增加,遠志高劑量組 Iκ B蛋白陽性細胞數(shù)顯著增加 (P＜0.05),但仍低于正常對照組和假手術組(P ＜ 0.05)。

表1 各組對大鼠海馬區(qū) NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽性細胞數(shù) [±s,例數(shù)(個)]

表1 各組對大鼠海馬區(qū) NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽性細胞數(shù) [±s,例數(shù)(個)]

注:與正常對照組和假手術組相比*P＜0.05;與模型組相比#-P ＜0.05。

組別 N F- κ B p65 P- Iκ B α Iκ B正常對照組 7.88± 2.42 17.88±5.00 35.13±5.67假手術組 8.25± 1.91 19.75± 5.01 33.75±6.04模型組 41.38± 5.13* 51.75± 6.99* 13.88±3.23*遠志低劑量組 32.63±4.96*# 38.00±4.44*# 15.25±2.71*遠志中劑量組 19.88±4.40*# 25.13±5.36*# 17.38±3.11*遠志高劑量組 22.13±4.46*# 24.50±3.74# 21.25±3.88*#

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學對阿爾茨海默病的病因和發(fā)病機制尚不明確,目前主要有β淀粉樣蛋白級聯(lián)學說、Tau蛋白學說、遺傳因素學說、慢性炎癥學說、氧化應激學說等。AD除了具有大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)元缺失、神經(jīng)纖維纏結、老年斑等病理特征以外,還伴隨著一個緩慢的炎癥病理改變過程[2]。Bales等也研究發(fā)現(xiàn),用 A β作用于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞后,能以時間一劑量依賴型的方式激活 N F-κB,并通過激活的 N F-κ B上調(diào) IL- lβ和 IL-6的表達。在 AD病人腦組織切片的免疫組化分析中發(fā)現(xiàn) NF-κ Bp65處于活化形式并且在神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞中處于激活狀態(tài),這些 NF-κB激活的細胞僅局限于老年斑的附近[3]。NF-κ B是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)可將信息從胞漿傳至細胞核并引起相應基因表達的重要轉錄因子。沒有外界刺激時,N F-κB在胞質(zhì)中與其 NF-κB抑制蛋白( IκB)結合,呈不具活性的狀態(tài)。許多刺激因子均可使 NF-κB活化,在這些因子的作用下,I κ B激酶(IKK)激活,使 I κ B磷酸化,泛素化,降解,從而使 NF-κB活化。NF-κB活化后其 p65亞基上的 NLS暴露,使活化的 NF-κB轉移入胞核,并與 DN A的 κ B反應元件結合,從而調(diào)節(jié)特異基因的轉錄表達。而由于 I κ B a啟動子含有 κ B結合的位點, IκB a的轉錄受到 NF κB的調(diào)節(jié),活化的 N F κ B能夠上調(diào) IκBa mNRA水平 ,新合成的 IκBa進入核內(nèi)與 NF κ B結合 ,使其從DN A上解離下來 (NF κ B與 IκB蛋白的親和力高于其與DN A的親和力), IκBa分子中的核輸出序列 N ES(nuclear export signal)再促使 N F κB重新回到細胞質(zhì)中[4]。遠志是自古以來的益智良藥,因此國內(nèi)學者用各種 AD模型從行為學研究、抗氧化、清除自由基、抗炎的作用,對神經(jīng)細胞的護作用及對中樞膽堿能系統(tǒng)的影響等方面對遠志的益智作用進行了相關研究。

通過實驗研究表明,遠志能夠抑制 AD模型大鼠海馬區(qū)N F κB活化,這種作用主要是通過抑制 IκB a降解而不是通過刺激 IκBa蛋白合成增加來實現(xiàn)的。遠志減輕 IκB a磷酸化的機理還需進一步探討。

[1]賈建平.神經(jīng)病學 [M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008,214-219

[2]Fiala M,Zhang I,Can X.Amyloid-beta induces chemokine secretion and monocyte migration across a human blood-brain barrer mode[J].Mol Med,1998,4(7):480-489

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[4]Tak PP,Firestein GS.NF-kappa B:a key role in inflammatory diseases[J].J Clin Invest,2001,107(l):7-11