生長因子在動物細胞培養(yǎng)中的作用

陳維

(魯東大學生命科學學院)

1 細胞培養(yǎng)的研究歷程

1885年，Roux最早使用溫生理鹽水使雞胚組織在體外生存長達數(shù)月，開啟了體外組織培養(yǎng)的萌芽時代。1907年，美國胚胎學家Ross Harrison 采用青蛙淋巴液做培養(yǎng)基，懸滴法使蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織在體外得以生長，從而建立了動物細胞培養(yǎng)的基本模式系統(tǒng)。之后又有許多學者對細胞培養(yǎng)的技術進行改進，1912年，Carrel采用血漿包埋組織塊外加胚汁的培養(yǎng)方法（懸滴法的一種），培養(yǎng)雞胚心肌組織長達數(shù)年之久。從此，細胞培養(yǎng)的基本技術建立起來。之后，科學家又在懸滴法的基礎上，不斷進行改進，優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立了單層細胞培養(yǎng)法、三維立體細胞培養(yǎng)法。利用體外培養(yǎng)技術，科學家建立了可以長期在體外生長培養(yǎng)的細胞株，其中，1943年，Earle建立的小鼠皮下組織L細胞株是最早建立的細胞株，給研究工作帶來了很大的方便。在此基礎上又相繼建立了許多細胞株，如Hela（1952年）、KB（1954年）、CHO（1957年）、NIH3T3（1970年）、Friend（1974年）、HL60（1977年）、COS-1（1981年）等。

目前細胞培養(yǎng)的技術已廣泛的應用于生物學的各個領域，如細胞生物學、分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學等研究。另外在醫(yī)學方面也有很重要的應用價值。由于經(jīng)過體外培養(yǎng)的細胞，其結構功能都十分接近體內情況，因此他們可以作為生物學的研究對象從而替代某些珍稀物種、進行醫(yī)學鑒定等。

縱使研究者想盡各種方法盡可能的模擬細胞的體內環(huán)境使其在體外進行與體內同樣的生長和傳代，但是始終無法做到完全相同。除了需要滿足水分、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及溫度、pH、滲透壓等物質和條件外，還需要生長因子等特殊的成分，體外的細胞才可能達到與體內近乎相同的生長形態(tài)。

2 生長因子的發(fā)現(xiàn)

1986年，Levi-montalcini和Stanley Cohen因為發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子和表皮生長因子以及它們的作用特征而榮獲諾貝爾醫(yī)學或生理學獎[1]。神經(jīng)生長因子（NGF）是最先被發(fā)現(xiàn)的生長因子。20世紀50年代初，Levi-montalcini在美國華盛頓大學的實驗室中進行外周組織對神經(jīng)細胞的生長和存活之影響的研究中發(fā)現(xiàn)：把鼠的腫瘤移植到雞的胚胎中，可產(chǎn)生一種彌散性的物質，這種物質能夠刺激神經(jīng)細胞的生長。并在以后的工作中與Stanley Cohen利用組織培養(yǎng)的方法分離出這種物質，命名為神經(jīng)生長因子。Levi-montalcini不但是神經(jīng)生長因子最早的發(fā)現(xiàn)者，她同時也是最早向體外培養(yǎng)細胞中加入生長因子的科學家。在隨后的幾十年中，科學家確定了NGF的化學成分、結構及作用機制。1962年，Stanley Cohen在實驗中，將含有NGF的唾液腺細胞提取物注射到新生小鼠體內時，發(fā)現(xiàn)小鼠的眼皮及牙齒有早熟的現(xiàn)象。因為這種物質能刺激皮膚及角膜中表皮細胞的生長，Stanley Cohen稱之為表皮生長因子（EGF），之后，他又明確了EGF的結構[2]。

EGF和NGF的發(fā)現(xiàn)以及之后對它們結構、作用機制的研究過程中，組織和器官的體外培養(yǎng)技術發(fā)揮了很重要的作用。因為研究者是在觀察整個實驗個體時，發(fā)現(xiàn)了這一物質，但如果想進一步證實是一種新物質，就必須進行細胞的體外培養(yǎng)才能盡可能的排除個體中其他物質對其的干擾，使實驗更有說服力。

Levi-montalcini和Stanley Cohen開創(chuàng)了研究生長因子的新領域，越來越多的研究者投身其中。各種不同功能的生長因子也相繼被發(fā)現(xiàn)：20世紀80年代，在Moloney小鼠肉瘤病毒轉化的3T3纖維母細胞條件化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了轉化生長因子[3]；1982年Gambarini等從牛垂體分離、純化了酸性成纖維細胞生長因子；在兩年后Bohlen等，取牛腦或垂體經(jīng)CMSephadex C-50，肝素-Sepharose親和層析，獲得了純化的堿性成纖維細胞生長因子[4]。

3 生長因子的分類

根據(jù)每種生長因子最初的發(fā)現(xiàn)組織不同，可以將生長因子分為神經(jīng)細胞生長因子、表皮細胞生長因子、成纖維細胞生長因子以及各種組織生長因子。各種生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的形態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。神經(jīng)細胞生長因子是最早被發(fā)現(xiàn)目前研究最為透徹的生長因子，它具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促突起生長雙重生物學功能，并對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。研究表明，神經(jīng)細胞生長因子可以抑制某些腫瘤的有絲分裂，促其向良性分化，在神經(jīng)母細胞瘤和膠質瘤的體外培養(yǎng)細胞中，也發(fā)現(xiàn)有促進分化作用[5]。神經(jīng)細胞生長因子能否成為臨床治療惡性腫瘤的一種新制劑，有待于進一步研究。表皮生長因子是最早確立結構的生長因子，表皮生長因子可以促進細胞有絲分裂以及糖、蛋白質、DNA、RNA合成；在促進細胞增殖的同時可以抑制細胞的衰老[6]，最近的研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子對于傳代培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細胞[7]以及體外培養(yǎng)的人角質細胞[8]的增殖具有一定的促進作用。成纖維細胞生長因子又可以分為酸性成纖維細胞生長因子和堿性成纖維生長因子，二者均可以在體外環(huán)境下刺激中胚葉來源的成纖維細胞或內皮細胞的增殖，另外堿性FGF還是有效的血管生成劑。研究證實，堿性FGF可以刺激體外兔干細胞的增殖和代謝[9]。

生長因子還可以分為內源性生長因子和外源性生長因子，外源生長因子即直接從生物體提取的成品生長因子，但是實驗中通常采用轉染的方法將編碼生長因子的基因序列導入到受體細胞中，從而使生長因子在細胞體內表達來促進細胞的生長、分化和繁殖。內源性生長因子較外源性生長因子的優(yōu)點在于它可以在細胞體內持續(xù)高效的發(fā)揮作用，還可以通過調控釋放來避免由于一次大量給藥而產(chǎn)生的潛在藥物毒性，能為組織再生提供最佳的有效劑量[10]。

3.1 外源轉內源的原因

現(xiàn)階段在細胞培養(yǎng)中使用的生長因子多為外源型的，即直接在培養(yǎng)基中加入成品生長因子，外源生長因子的半衰期短，局部使用容易被稀釋，而且需要反復給藥。另外，無論從濃度上還是從生長因子的種類上說都是憑經(jīng)驗，沒有具體的加入劑量和加入種類。因此在實驗中生長因子的量同樣也是影響細胞培養(yǎng)的因素之一。再者，現(xiàn)階段使用的生長因子大多是從胎牛血清中提取的，價格相對來說較昂貴，不適合在實驗中廣泛使用。如果將編碼生長因子的基因導入到待培養(yǎng)的細胞基因組中，使其成為內源型生長因子，可以大大降低生長因子的成本，另外對于細胞所需要的生長因子的濃度可以通過基因調控來控制，從而使生長因子在實驗中發(fā)揮最重要的作用。由于在細胞培養(yǎng)過程中往往不僅僅只加入一種生長因子，因此在制備內源型生長因子時可以一次性將多種生長因子的基因導入到受體細胞中，以表達不同的生長因子。

3.1.1 轉染生長因子基因的步驟

目前在干細胞培養(yǎng)及促進細胞分化中應用細胞生長因子的例子比較多，例如將胰島素樣生長因子的基因轉染至兔脂肪間質干細胞中以促進細胞的增值[10]。主要實驗方法如下：對以獲取的組織細胞進行原代培養(yǎng)，并進行傳代；細胞活力、密度以及各特性的鑒定；符合條件后，將含有生長因子基因的質粒載體轉染至細胞中并進行傳代培養(yǎng)；以未轉染組和轉染空質粒載體的細胞作為空白對照，進行轉染后的鑒定。主要的鑒定方法有：應用RT-PCR對生長因子mRNA的表達情況進行鑒定；應用Western blot法檢測生長因子蛋白的表達情況。

4 生長因子作用的分子學機制

生長因子作為一種信號分子它是一種局部介質，它能夠調節(jié)多細胞生物的細胞生長和分裂，作用的靶細胞主要是臨近的細胞。由于生長因子的大多數(shù)是親水性物質，因此它不能穿過靶細胞質膜的脂雙分子層，只能通過與細胞表面的受體結合，在經(jīng)信號轉換機制，在細胞內產(chǎn)生第二信使或激活蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性，從而引起細胞的應答反應，促進細胞的增殖和生長。不同的生長因子具有不同的受體進行信號轉導：表皮生長因子的受體為，酪氨酸既沒活性的多功能跨膜糖蛋白；神經(jīng)細胞生長因子的受體為，低親和力的神經(jīng)生長因子受體和高親和力的酪氨酸激酶家族受體；成纖維細胞生長因子的受體有三種，酪氨酸激酶受體、富胱氨酸成纖維細胞生長因子受體以及低親和力的受體肝素硫酸糖蛋白；轉化生長因子的受體為，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體。

5 各種生長因子在細胞培養(yǎng)中的研究歷程

5.1 神經(jīng)細胞生長因子在細胞培養(yǎng)中的應用

神經(jīng)生長因子是最早被發(fā)現(xiàn)的生長因子，同時它也是最早應用于體外細胞的一類生長因子，在Levi-montalcini發(fā)現(xiàn)并證實了神經(jīng)細胞生長因子存在后，它向體外培養(yǎng)的雞胚中加入該生長因子，觀察其對雞胚中神經(jīng)細胞生長的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞生長因子能使感覺神經(jīng)節(jié)及交感神經(jīng)節(jié)數(shù)目增加，體積增大，神經(jīng)纖維延長。神經(jīng)細胞生長因子對正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化及維持神經(jīng)元特殊功能有重要的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起修復、營養(yǎng)作用[11]。神經(jīng)細胞生長因子不僅對神經(jīng)系統(tǒng)，而且對內分泌和免疫系統(tǒng)都發(fā)揮重要的作用，是一種能抵抗各種疾病的全能武器，正如Levi-Montilini所說，NGF的臨床應用有著迷人的希望。

在對細胞進行體外培養(yǎng)的時候，NGF也經(jīng)常被用到。研究發(fā)現(xiàn)，在觀察神經(jīng)生長因子對體外培養(yǎng)的垂體催乳素瘤細胞的作用時發(fā)現(xiàn)NGF可以刺激人的垂體PRL分泌腺瘤細胞激素從而間接起到抑制腫瘤細胞增殖的作用最適合，所使用濃度為2 ng/μl[12]；NGF還可以促進人牙乳頭間充質細胞的增殖，其濃度為100 U/mL時刺激細胞的增殖作用最強，當濃度為1000 U/mL時反而會抑制細胞的增殖[13]。

5.2 表皮細胞生長因子在細胞培養(yǎng)中的應用

目前表皮生長因子多用于臨床，體外培養(yǎng)表皮細胞覆蓋燒燙傷創(chuàng)面，對成纖維細胞、角質形成細胞以及癌前病變的細胞、腫瘤細胞等具有促增生的作用?？梢酝ㄟ^向無血清的培養(yǎng)基中添加生長因子的方法精細研究生長因子在細胞培養(yǎng)中的作用[14]，結果顯示表皮生長因子可以促進表皮細胞的增殖、細胞生長和分化。正常的表皮細胞角質化死亡是一種特異類型的生理性細胞凋亡，但是表皮細胞凋亡也可由環(huán)境因素誘導發(fā)生，如低溫、熱休克、紫外線、射線，超氧化物、干擾素及細胞毒等都具有觸發(fā)凋亡的作用。細胞的過度或持續(xù)凋亡會造成細胞染色體結構破壞、DNA損傷與突變、基因穩(wěn)定性喪失、基因表達模式的改變，表現(xiàn)出細胞增殖和生長的抑制。實驗證明在表皮生長因子存在的情況下，凋亡的發(fā)生率很低，細胞生長健壯并具有分裂的形態(tài)特征，反之，細胞則表現(xiàn)為典型的凋亡形態(tài)[15]。

不同濃度的表皮生長因子對細胞增殖的促進作用不同，在一定濃度范圍內，隨著表皮生長因子濃度的增加，其對細胞的促增生作用也不斷增強，超過此范圍后，隨著其濃度的增加這種促增生作用有所下降，甚至會產(chǎn)生抑制效應。這可能與表皮生長因子的受體消耗以及細胞自身的負反饋有關，效濃度的重要性，否則過度的使用該因子會產(chǎn)生負面的效果，影響臨床效果[8]。細胞的增殖和生長對于生長因子濃度不盡相同，如在角膜上皮細胞進行傳代是要求的濃度為10 ng/mL[16]，在培養(yǎng)人角質細胞增殖是最適濃度為0.1-1 ng/mL[8]，在傳代培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細胞時最適濃度為1 ng/mL[7]。

5.3 成纖維細胞生長因子在細胞培養(yǎng)中的應用

FGF是一種多功能的肝素結合的蛋白質，但是這種多功能作用多與神經(jīng)系統(tǒng)有關，它可以協(xié)同其它神經(jīng)營養(yǎng)因子作用，促進神經(jīng)系統(tǒng)和感覺系統(tǒng)細胞的生長[17]。FGF可以促進細胞的增殖，加快細胞倍增，尤其能縮短細胞周期的G1期的時間。FGF對中胚層來源細胞是一個強有力的致分裂源。同時，它可以穩(wěn)定細胞的表現(xiàn)型、促進細胞的定向分化并且有明顯的延緩細胞老化、促進傷口愈合和血管生成的作用[18]。人和小鼠的FGF6基因以及它的產(chǎn)物可以促進肌肉細胞的生長[19]。

近幾年FGF在細胞培養(yǎng)中的應用主要有：bFGF在濃度為10～100 ng/ml時對小鼠和兔的胚胎脊髓神經(jīng)細胞的生長和發(fā)育有明顯的促進作用，但是當bFGF的濃度為200 ng/ml時則會抑制細胞的生長和發(fā)育，細胞的存活率明顯下降[20，21]；aFGF對體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞有明顯的促生長和增殖作用，在濃度為0.45 mg/L時可以看到細胞數(shù)量明顯增多，促增殖作用明顯[22]。

6 生長因子在細胞培養(yǎng)中應用的前景展望

由于體外培養(yǎng)的細胞在研究起來較成體研究有很大的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在經(jīng)濟性和方便性，可以彌補成體缺乏等一系列的缺點。目前細胞培養(yǎng)的技術已廣泛的應用于生物學的各個領域，如細胞生物學、分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學等研究。因此對所培養(yǎng)細胞的質量和數(shù)量就有較高的要求。各種生長因子的加入使這一要求變得簡單，近幾年越來越多的研究者置身于研究生長因子在細胞培養(yǎng)中的作用，包括濃度以及培養(yǎng)時間對于所培養(yǎng)細胞的影響。對于一些不好培養(yǎng)但是又有重要研究價值的細胞系，加入生長因子無不是一種可行的方法。例如在研究一些稀缺物種時，由于數(shù)量有限采用成體作為研究對象是不可行的，只有培養(yǎng)出該物種可以傳代的細胞系，以細胞系作為研究對象，才能進行更加深入的研究，保護物種繼續(xù)生存。同時內源生長因子較外源生長因子也有很大的優(yōu)勢，因為內源生長因子是直接由培養(yǎng)的細胞來調控生成生長因子的數(shù)量和種類，更能夠促進細胞的增殖，避免其他不必要因素的干擾。隨著生物研究的不斷深入各學科之間的交叉也越來越多，各種不同的實驗技術也相繼產(chǎn)生，生長因子在細胞培養(yǎng)中的應用也將不斷發(fā)展，并逐漸應用到生物學的不同領域中去。

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