牛結核病檢測診斷技術研究進展

宋振忠，鐘旗，徐志光，許禮義，呼西旦

（新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium)引起的人、畜、禽共患的一種慢性傳染病，由人結核分枝桿菌(MTB)、牛分枝桿菌(MB)、禽型分枝桿菌(M, avium)、非洲分枝桿菌以及田鼠分枝桿菌（M,microti）所引起，統(tǒng)稱這些病原為結核分枝桿菌復合物(或群)。

目前已知，結核病除感染人外還能使50多種哺乳動物和25種禽類感染，牛是最敏感的動物。牛結核主要由牛分枝桿菌引起，人結核的10%以上由牛分枝桿菌引起。每年，世界上大約有3百萬人感染牛結核桿菌造成結核病。中國是世界上感染結核病較高的22個國家之一。由于牛和人類的關系(牛奶、牛肉及耕牛等)較其他動物更為密切，因此，牛結核又是任何其他動物結核病最大的傳染源。其傳染和流行嚴重地影響到畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，不僅可以造成奶牛乳房炎、結核性胸膜炎等疾病，還能造成牛奶產乳率和乳質下降，更嚴重威脅著人類的身心健康。牛結核病被國際獸疫局定為B類傳染病，我國將其列入二類動物疫病。

結核分枝桿菌按其致病力可分為3種型，即人型、牛型和禽型，三者有交叉感染現象。牛型主要侵害牛，其次侵害人、豬、馬、綿羊和山羊等，在所有牛種中奶牛最為易感。牛分枝桿菌共可感染50多種哺乳動物。

本病無季節(jié)流行性，一年四季均可發(fā)生，在農村主要以散發(fā)為主，規(guī)?；B(yǎng)牛場主要以區(qū)域性流行為主。牛結核病的潛伏期一般為16～45 d，或者更長，通常為慢性。在感染初期幾乎不表現出特有的臨床癥狀。感染一段時間后，一般日漸消瘦，精神不振，頻頻咳嗽，毛粗無光，皮膚失去彈性，食欲不振，產奶量下降等臨床癥狀。由于牛感染結核病的經過往往比較緩慢，根據動物患病器官的不同，表現出的臨床癥狀也各不一致。牛結核病的臨床癥狀主要分為以下幾種類型：肺結核、乳房結核、腸道結核、淋巴結核和生殖結核等。

目前，在結核病的監(jiān)測和診斷中，普遍采用結核菌素皮內實驗（TT）、細菌痰涂片、細菌的分離培養(yǎng)等傳統(tǒng)的技術。隨著科學技術的進步，免疫學和分子生物學技術有了很大的發(fā)展，出現了很多適合結核病檢測的先進技術，本文就對這些新老技術進行簡要的概述。

一、檢測診斷技術的概述

（一）細菌學檢測技術

1.結核桿菌的生物學特征。結核桿菌大小為0.2～0.5 μm×1.5～4.0 μm，兩端鈍圓，無芽胞和莢膜，無鞭毛，不運動，革蘭氏染色呈陽性。人型結核桿菌細長而稍彎曲，牛型略短而粗，禽型小而粗，而且略具多形性。本菌由于細胞壁中含有大量的糖脂，普通的染色方法很難使其著染。通常采用萋爾-尼爾遜抗酸染色法進行染色，抗酸桿菌呈特征性的紅色，而其它細菌和細胞呈藍色。

2.結核桿菌的培養(yǎng)特性。通常采集患病動物的尿液、痰、胸水、腹水、膿液或傷口分泌物和肺、淋巴結等有典型鈣化灶的病變器官進行細菌的分離培養(yǎng)。本菌為專性需氧菌，對營養(yǎng)要求嚴格，常用羅杰二氏培養(yǎng)基、改良的羅杰二氏培養(yǎng)基、丙酮酸培養(yǎng)基和小川培養(yǎng)基培養(yǎng)。最適生長溫度為37℃～37.5℃。本菌生長緩慢，特別是初代培養(yǎng)，一般需10～30 d才能看到菌落。其生長速度依次為禽分枝桿菌，結核分枝桿菌，牛分枝桿菌。菌落粗糙、隆起、不透明、邊緣不整齊，呈顆粒、結節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色。在液體培養(yǎng)基里，因菌體含類脂而具疏水性，形成浮于液面有皺褶的菌膜。傳統(tǒng)的結核桿菌臨床診斷一般依賴于細菌學方法，其中痰涂片抗酸染色法快速，但靈敏度低，特異性差，需要觀察者有豐富的經驗積累，且至少需要有大于5×106/L的細菌才能檢測到陽性結果，而且無法區(qū)分MTB和非MTB感染，同時不能區(qū)分死菌和活菌。此方法培養(yǎng)時間較長(至少2個月)，已很難滿足生產與生活的需要。但是不論是何種檢測技術最終的完全確診還要以羅杰(L-J)固體培養(yǎng)法為金標準。

（二）免疫學檢測技術 結核分枝桿菌是細胞內寄生菌，因此機體抵抗結核分枝桿菌的感染主要依靠細胞免疫。在機體感染了結核分枝桿菌后，最早在機體內引起的是細胞免疫；而體液免疫是隨著感染時間的延長而緩慢的增強；細胞免疫在結核桿菌感染的后期又不表現出來，所以要準確的判斷動物所處的感染期，以采用合適的檢測方法。

1.結核菌素皮內試驗（TT）。用各種提純的結核菌素（PPD）皮內注射動物，一段時間后根據皮厚差來判斷結核病的一種方法。目前該方法被世界各國廣泛采用，并且是世界動物衛(wèi)生組織OIE推薦的診斷牛結核病的唯一方法。該方法檢出率和準確性都比較高，但用該方法不能區(qū)分致病性分枝桿菌和非致病性分枝桿菌感染，更不能區(qū)分致病性結核桿菌的型、在用BCG免疫的地區(qū)或國家，不能區(qū)分自然感染和免疫個體、對感染嚴重的個體有可能出現假陰性的結果、在一段時間內（30 d），由于遲發(fā)性變態(tài)反應（DTH）不能重復進行、必須進行嚴格的質量控制，否則嚴重影響結果。同時此技術操作要求較高，主觀性比較大，不能進行大規(guī)模的流行病學調查。

2.間接ELISA法（iELISA）。根據抗原在固體支持物上的吸附性及抗原抗體的特異性與酶的高效性的原理而設計的方法。該方法簡單易行，無需特殊精密儀器；能夠大規(guī)模的進行流行病學調查，且具有高特異性高敏感性的特點，所以在結核病血清學診斷方面研究最多，目前該方法主要作為PPD的一個補充。但該方法由于觀察對象不同、檢測使用抗原不同、質量控制困難等影響了該實驗的結果，導致其結果差異較大。早期采用PPD作為檢測抗原，隨著分子生物學和基因工程技術的發(fā)展，大量的蛋白在體外獲得并用于診斷抗原的研究。該方法較PPD-ELISA具有更高的特異性，但敏感性有所下降。據報告，ELISA法檢測結核抗體的敏感性為62.0%～94.7%，特異性為91.2%～94.0%。因此，目前此法仍不失為結核病、特別是肺外結核診斷中有價值的實驗室診斷方法之一。

3.免疫斑點測定法。即以硝酸纖維膜代替免疫滴定板，以特異的結核菌抗原致敏結合在纖維膜帶上，再與檢測血清反應，繼之以酶標記的抗牛IgG偶聯(lián)反應后進行顯色反應，用肉眼或光密度計與標準斑點比較，此法更易施行。有人認為可作為初篩試驗。目前已有商品采用膠體金與蛋白質A結合物代替酶與第二抗體偶聯(lián)，可在數分鐘至20 min內完成。

4.免疫印跡法。是利用SDSPAGE技術與酶的高敏感性相結合的技術。首先用SDS-PAGE把蛋白按分子量分開，再把分開的蛋白轉移到硝酸纖維膜上，用檢測血清來進行中和反應。繼之以酶標記的抗牛IgG偶聯(lián)物，再加底物顯色，觀察結果進行分析。此法過于復雜，但有助于新抗原的鑒定研究。陸學東等以此技術檢測496例結核病，610例正常人及非結核病病人的血清，其敏感性90%，特異性96%。優(yōu)于同時進行的ELISA法。作者還發(fā)現30～43KDa多肽成分是主要的診斷抗原成分。

5.淋巴細胞增生實驗。致敏的外周血淋巴細胞（PBLC）在特異性抗原的刺激下，可使抗原特異性T淋巴細胞亞群發(fā)生增生性反應。然后用同位素或5-溴脫氧尿苷標記，配合流式細胞儀，可對其進行識別和計數。通過測定外周血循環(huán)中的增生淋巴細胞的比例可了解淋巴細胞增生的程度，間接反映淋巴細胞被特異性抗原致敏的情況，從而分析動物機體對結核桿菌的細胞免疫狀態(tài)。該方法試驗耗時而且前期準備以及試驗操作都比較復雜，比如需要較長的孵育期和要使用放射性核苷酸，所以在常規(guī)的牛結核病診斷中并不被采用，而僅僅用于野生動物以及動物園動物的檢測。

6.IFN-γ檢測法。IFN-γ又稱Ⅱ型干擾素，是一種由CD4+TH1、CD8+T型細胞以及NK細胞產生的細胞因子，它不僅具有Ⅰ型IFN(α-干擾素、β-干擾素)的抗病毒和抗腫瘤活性，更重要的是還具有促進MHCⅡ類抗原表達、增強APC細胞與T細胞的相互作用、增強T細胞輔助抗體產生和細胞毒性T細胞產生的能力等諸多免疫調節(jié)活性。其原理是當從感染牛獲得的致敏淋巴細胞再次遇到牛提純結核菌素(主要是MTB特異性的蛋白抗原，如ESAT-6、CFP-10)，可以在體外模擬延遲型過敏反應(DTH)，從而使得致敏淋巴細胞釋放相對大劑量的γ干擾素。而γ干擾素可以用IFN-γ的免疫學檢測方法檢測到，沒有感染的牛，其淋巴細胞再次遇到抗原時，并不釋放γ干擾素。因此，檢測到γ干擾素與牛型結核分枝桿菌的接觸具有相關性。檢測方法是將試驗牛的血液淋巴細胞培育，加入特異性的抗原一起孵育16～24 h，致敏的淋巴細胞釋放出IFN-γ，以IFN-γ-ELISA進行定量測定。

體外IFN-γ釋放反應除特異性較高外，還有以下一些優(yōu)點，結果較為客觀，24～48 h可完成，不會激發(fā)記憶性免疫反應。但其最大的缺點是價格昂貴，因而短時間內較難普遍推廣。γ-干擾素測定法的廣泛性田間試驗己在世界上許多國家(包括澳大利亞、愛爾蘭、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國)完成，并在澳大利亞和新西蘭被認可為正式試驗。目前已有20多萬頭經過測試，本法敏感性為77%～93.6%，而相對于PPD試驗的敏感性為65.6%～84.4%，特異性為98.1%。

（三）分子生物學檢測技術

1.結核桿菌的基因組特征。牛分枝桿菌AF2122/97基因序列全長4,345,492 bp，其中GC含量為65.63%，含有3952個編碼蛋白的基因，一個噬菌體和42個插入元件。其基因組在核酸水平上與人型結核分枝桿菌有大于99.95%的同源性，二者之間表現出明顯的線性相關,但并未表現出廣泛的易位、重復或翻轉。在牛結核分枝桿菌基因組中有11處基因缺失，大小范圍為1～12.7 kb。

研究發(fā)現，人型復合分枝桿菌(包括人結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌、非洲型分枝桿菌以及田鼠分枝桿菌)中存在一些插入序列(IS)可作為探針用于結核病的診斷,同時采用限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)技術對人型復合分枝桿菌能進行種水平的鑒定分型研究。研究最廣泛的是與腸桿科中插入片段相類似的插入基因片段,包括IS6110,IS986和IS987。這些基因片段都只存在于人型復合分枝桿菌中, 并以多拷貝形式出現。近年發(fā)現人型復合分枝桿菌中還含有第二類插入序列IS1081,它與IS6110極為不同, 但與金黃色葡萄球菌中IS256相似。IS1081也只存在于人型復合分枝桿菌中,拷貝數為6個。

2.用于結核病檢測的主要分子生物學技術。用于結核病的診斷技術主要有核酸擴增技術、基因探針技術、PCR與基因探針相結合的技術、DNA指紋圖譜檢測法、基因測序法和生物芯片技術等。

(1)核酸擴增技術。PCR是一種根據核酸復制原理采用分子技術模擬細胞內核酸復制過程的DNA或RNA體外擴增技術。1989年,Hance等最先報道將PCR技術應用于結核分枝桿菌（TB）的檢測。PCR檢測方法的突出特點是靈敏度高,可以檢測出1～100 fg純化的分枝桿菌DNA, 相當于1～20個MTB, 與傳統(tǒng)的痰涂片抗酸染色和MTB培養(yǎng)方法相比,其敏感性得到了大大提高。此外, 與傳統(tǒng)檢測方法相比,PCR檢測的報告周期短, 1～2 d即可發(fā)出報告, 因此對于TB的早期診斷具有獨到的優(yōu)勢。

(2)基因探針技術?；蛱结樐茏R別特異核苷酸序列的帶標記的核酸分子，也就是分子雜交。采用放射性同位素和地高辛、光敏生物素、化學發(fā)光和熒光等非同位素標記。目前已建立了菌落雜交、斑點雜交、微孔板雜交和原位雜交等方法。DNA探針技術最大的優(yōu)點是高的特異性，但敏感性并不是很理想，多數探針只能檢出106個細菌/L以上的標本，需依賴純培養(yǎng)，因此受到很大限制。張玲霞等研究表明，DNA探針直接用于TB患者痰標本的陽性率為22.2%，低于涂片抗酸染色檢查。

(3)PCR與基因探針相結合的方法。PCR方法與基因探針技術的結合一方面可以克服探針技術敏感性不強的缺點，另一方面，核酸探針的引入可消除很大一部分PCR因非特異性擴增帶來的假陽性結果。因此，這兩者的結合同時具備了高度敏感和高度特異的特點，代表了TB分子生物學診斷發(fā)展的一個主要方向，是目前TB分子生物學診斷方法中最有研究和應用價值的方法，也是目前臨床上應用最為廣泛的方法。由于PCR方法、可用的核酸探針的種類、探針的標記及其檢測方法多種多樣，因此PCR與基因探針結合產生的新技術也是多種多樣，較為重要的有：熒光定量PCR技術、基因探針擴增直接實驗、PCR-ELISA技術和PCR-分子信標技術等。

(4) DNA指紋圖譜技術。其基本原理是用限制性內切酶消化結核分枝桿菌染色體DNA上的特定的核苷酸序列，在瓊脂糖凝膠電泳中分離后，將限制性片段轉移至膜上，與帶標記的DNA探針雜交，檢測出與探針同源的限制性片段。這些片段數目和大小的變化使每株分離株呈現特征帶型即指紋圖譜型。目前用于菌株分型的遺傳標記普遍采用插入序列或其他重復序列作為分型的標記。IS6110 DNA指紋圖譜在結核病上可有效的鑒定菌株，已解決多種流行病學問題，已證明是一種有力的流行病學研究手段，但目前這種技術在臨床上應用還很有限，只是選擇性的對臨床分離株進行基因分型，大規(guī)模的應用還有賴于DNA指紋圖譜標準方法的推廣、譜型計算機軟件的開發(fā)和實驗室技術人員素質的提高和實驗條件的改善。

分子生物學方法以其敏感性好、特異性高和檢測快速等特點，在結核病的診斷中發(fā)揮著巨大優(yōu)勢，并取得了較好的效果。但由于分子技術的高靈敏性和低特異性，或其他的一些或多或少的不足，導致這些方法都待進一步的成熟和完善。且多數分子生物學檢測有賴于先進的檢測儀器和獨立的實驗室，很難在基層實驗室普及。因此，分子生物學技術到現在還無法取代結核病的傳統(tǒng)檢測方法。

二、結語

牛結核病是一種慢性消耗性疾病，一般區(qū)域性流行，具有感染率高而發(fā)病率低等特點。

傳統(tǒng)的病原學檢測方法雖然簡便、經濟、易行，但靈敏度低，特異性差，需要標本中有一定數量的細菌方能檢出抗酸菌。但細菌的分離和培養(yǎng)，需花費大約3～8周的時間，若再進行菌株的分型鑒定和藥敏實驗又需要1～3個月的時間，這對于結核病的早期診斷與治療無益。

目前臨床上應用最廣泛的是遲發(fā)性變態(tài)反應(DTH)試驗，即結核菌素試驗。該方法在牛結核病的診斷和防制過程中起到了重要的作用,美國和歐共體的許多國家利用該方法消滅和控制了牛結核病,以至于現在世界動物衛(wèi)生組織仍以該方法作為牛結核病法定的檢疫方法。研究發(fā)現，在相當數量的結核菌素試驗陽性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結核菌，或僅僅分離出非典型的分枝桿菌，給基層的撲殺工作帶來困難，因此在實際工作中用于診斷牛結核病并不十分理想。目前一些國家采用比較結核菌素試驗(即比較皮內試驗，SlCTT)。該方法在頸部一側的不同部位，同時注射M.bovis PPD和M.avium PPD。對兩種PPD的不同反應，能夠提示被檢動物是M.bovis感染還是非特異的DTH反應。楊經緯用傳統(tǒng)的牛型PPD試驗發(fā)現，在檢出的98頭陽性牛中，用比較變態(tài)反應試驗發(fā)現7頭為陰性，證實我國禽結核桿菌等非典型分枝桿菌確實影響了牛結核的檢疫。使用比較變態(tài)反應，可以有效降低變態(tài)反應的非特異性反應。該方法適合在我國普遍推廣。

γ-干擾素試驗已在許多國家(澳大利亞、愛爾蘭、新西蘭、阿根廷、美國等)完成了田間試驗，證明該方法的敏感性為77%～93.6%，高于結核菌素試驗的敏感性(65.6%～84.4%)。IFN-γ 測 定 法不僅消除了結核菌素試驗結果解釋的主觀性，而且縮短了試驗的時間。但是γ-干擾素試驗最大的缺點是價格昂貴，但目前國內已經研制出了國產的γ-干擾素試驗試劑盒，隨著臨床試驗數據的完善，γ-干擾素試驗存在的問題也會迎刃而解。

因此，在牛結核病的監(jiān)測和檢疫中，筆者認為應用比較皮內試驗或者γ-干擾素試驗能很快的提高牛結核病的檢出率，對于目前牛結核病的防控具有重要的現實意義。

（略）