化感物質(zhì)的提取、分離及鑒定方法的研究

陳紹莉 周寶利

（遼寧省果蠶管理總站 110034）（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）

化感作用屬于化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究范疇，是一門新興學(xué)科。化感作用的英文為 “Allelopathy”，源于希臘語“Allelon（相互）”和“Pathos（損害、妨礙）”。1937年Molish首先將其定義為：某種植物（包括微生物）生成的化學(xué)物質(zhì)對其他植物產(chǎn)生某種作用的現(xiàn)象。隨著科學(xué)研究的迅速發(fā)展，對化感作用的認(rèn)識也在不斷深入和全面。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中將其較完整地定義為：植物或微生物的代謝分泌物對環(huán)境中其他植物或微生物的有利或不利的作用。化感作用在生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，并通過化感物質(zhì)對受體起化感作用。因此，對化感物質(zhì)的認(rèn)識及研究十分重要，其中，提取、分離和檢測化感物質(zhì)是正確、全面認(rèn)識化感現(xiàn)象的前提。

1 化感物質(zhì)的種類

迄今為止所發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)主要有：水溶性有機(jī)酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮、簡單不飽和內(nèi)酯、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、簡單酚、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類、類黃酮、單寧、內(nèi)萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等。其中，最常見的是低分子量有機(jī)酸、酚類和內(nèi)萜類化合物。

2 化感物質(zhì)的提取方法

化感物質(zhì)可以通過浸析、揮發(fā)、植物殘?bào)w分解和根系分泌等方式進(jìn)入環(huán)境中。根據(jù)化感物質(zhì)的作用途徑，通常分別采用夾層法、常溫吸附法、浸提法或腐解法和疏水性根滲出液連續(xù)收集法（CRETS）等方法提取?；形镔|(zhì)的復(fù)雜性，使得化感物質(zhì)的提取收集比較困難。

目前，人們最常用的是浸提法收集化感物質(zhì)。浸提劑主要是兩類化合物：一是無機(jī)化合物，如：H2O、NaOH、Na4P2O7等；二為有機(jī)化合物，如：甲醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇等等。土壤中的化感物質(zhì)主要是以游離態(tài)和可逆束縛態(tài)的形式存在于土壤溶液中，選用NaOH和Na4P2O7作為浸提劑可將植物殘?bào)w和土壤有機(jī)質(zhì)中的酚酸類物質(zhì)提出；有機(jī)溶劑（如：氯仿）能夠直接從枯枝落葉、土壤腐殖酸和微生物膜中提取出化合物，但是，使用有機(jī)溶劑提取出來的化感物質(zhì)與自然條件下所產(chǎn)生的在質(zhì)和量上均有所區(qū)別。所以，選擇浸提劑時應(yīng)全面、慎重地考慮，以便使檢測結(jié)果更加真實(shí)可靠。

在浸提過程中，一般采用往復(fù)式振蕩和索式提取的方法進(jìn)行，然而這些方法在處理樣品時，浸提時間較長并且浸提不完全，樣品容易損失。另外，還可以采用超聲波方法浸提，由于超聲波深層的超聲破碎作用，從理論上說能夠省時，并且浸提更加完全，但實(shí)際操作條件還有待于進(jìn)一步的研究。

Tang和Young提出的連續(xù)抽提系統(tǒng)比溶劑提取方法更有效，并有助于從未擾動的根際中分離和鑒定化感物質(zhì)。最近，劉秀芬等在減壓條件下，用帶有多孔陶頭的塑料管原位收集土壤溶液，并成功地鑒定出了以前未見報(bào)道的化感物質(zhì)對二叔丁基苯甲酸，其對玉米和小麥生長發(fā)育的抑制作用明顯強(qiáng)于同濃度的常見化感物質(zhì)苯甲醛和阿魏酸。另外，同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用使得在自然環(huán)境中進(jìn)行根系分泌物的研究成為可能。Meharg等用14CO2標(biāo)記黑麥草，在溫室中成功地進(jìn)行了土壤微生物作用下根分泌物的研究。有時，為了強(qiáng)調(diào)防止某些化感物質(zhì)被氧化，必須在充滿氮?dú)鈼l件下進(jìn)行提取。

3 化感物質(zhì)的分離和純化

提取得到的混合物必需經(jīng)過純化才能進(jìn)行儀器檢測。常見的純化方法有：萃取法、樹脂法和層析法。

3.1 萃取法

根據(jù)化感物質(zhì)在兩個不相溶或部分互溶的溶劑中的分配度（溶解度）不同，從而達(dá)到分離純化的目的。此法雖操作繁瑣，不夠精確，但由于所用器械簡單方便，快速易行，現(xiàn)在仍被廣泛使用。由于化感物質(zhì)在常用有機(jī)溶劑（如：乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等）中的溶解狀況不同，可以使用不同有機(jī)溶劑反復(fù)萃取將含有的化感物質(zhì)全部提出來。

3.2 樹脂法

這是近年來發(fā)展起來的一種新方法，根據(jù)分離機(jī)理不同，分為交換法和吸附法。交換法是利用陽離子和陰離子樹脂，吸附陰陽離子，無極性或極性較弱的有機(jī)分子通過，然后洗脫和提取目標(biāo)組分，從而達(dá)到純化的目的；吸附法則是使用吸附樹脂 （如：XAD-24、XAD-22或GDX-2102樹脂以及硅膠等）吸附和富集含化感物質(zhì)在內(nèi)的一些有機(jī)化合物，達(dá)到分離和純化的目的。

3.3 層析法

一般常用紙層析和柱層析法分離和純化化感物質(zhì)。自從Rulen在本世紀(jì)中葉提出用柱層析測定植物組織中的有機(jī)酸后，層析法便被廣泛地用于土壤中化感物質(zhì)之一的有機(jī)酸的研究。但柱層析法手續(xù)繁復(fù)，且時間長；而紙層析和薄板層析法雖操作簡便，但不夠精確，所以它們現(xiàn)在基本上已不作為檢測手段了。

4 化感物質(zhì)的鑒定

化感物質(zhì)多數(shù)為次生代謝產(chǎn)物，數(shù)量甚微，而且有的易揮發(fā)或在空氣中易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因而，其檢測方法在很大程度上依賴于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步。近年來，近代實(shí)驗(yàn)物理方法在化學(xué)分析上的應(yīng)用給新發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定帶來了比較簡單而準(zhǔn)確的方法。根據(jù)測定熔點(diǎn)、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜等參數(shù)來判斷其中存在的功能團(tuán)、共軛體系、該未知物質(zhì)的分子量和結(jié)構(gòu)以及H原子和C原子在分子中的結(jié)合方式等信息，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，最后根據(jù)測定的結(jié)構(gòu)用已知的標(biāo)樣或合成的標(biāo)樣來鑒定化感物質(zhì)的含量。

伴隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和現(xiàn)代化儀器設(shè)備的更新?lián)Q代，特別是電腦分析控制程序的普遍應(yīng)用，利用氣相色譜（GC）技術(shù)、高效液相色譜（HPLC）技術(shù)和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)研究化感物質(zhì)獲得了很大的發(fā)展。其中，可由GC分析的物質(zhì)，其沸點(diǎn)在500℃以下，分子量要小于450，而熱穩(wěn)定性差、易于分解、變質(zhì)以及具有生理活性的物質(zhì)，不適合使用GC檢測，GC所分析的物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的15%～20%；HPLC的使用范圍較廣，可檢測的物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%～85%，但在HPLC廣泛應(yīng)用的同時，GC仍然發(fā)揮著重要作用。把色譜儀的分離裝置作為質(zhì)譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)，把質(zhì)譜儀作為色譜儀的檢測系統(tǒng)，即把色譜儀的高分辨率和質(zhì)譜儀的高鑒別能力結(jié)合起來，組成GC-MS或液相-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）儀器，是目前解決復(fù)雜未知物定性問題的最有效工具之一。

植物化感作用機(jī)理及應(yīng)用的研究，已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)之一。為了更好的研究化感作用，研究的方法也要不斷進(jìn)行完善和探索，逐步建立一套操作簡潔、檢測快速、批量篩選、針對性強(qiáng)和檢測結(jié)果可比性好的體系，加速其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。