分子生物學(xué)技術(shù)在病原真菌鑒定中的應(yīng)用

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用，真菌感染性疾病不斷增多，故而其菌種鑒定在臨床診斷、治療中起著重要指導(dǎo)作用。真菌感染的診斷以往主要以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，但這些方法費(fèi)時費(fèi)力，并且檢測陽性率很低；目前飛速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為病原真菌的生物學(xué)特性研究提供了可能，本文對這幾種分子生物學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)及在病原真菌鑒定分型研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR技術(shù)是一種特異擴(kuò)增DNA的體外酶促方法，可用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA。而改進(jìn)的PCR技術(shù)如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR(mutiplex PCR)、熒光PCR技術(shù)等則又在較大程度上增加了該技術(shù)的敏感性與特異性。近年來，PCR方法已滲透至臨床檢測的各個領(lǐng)域，并逐漸應(yīng)用于真菌病的診斷中。

根據(jù)真菌的保守序列設(shè)計(jì)通用引物，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，判定感染真菌的種類則需應(yīng)用屬種的特異性引物。前者最常選用的靶基因是核糖體蛋白基因（rDNA），其亞基序列（18S和28S）相對保守，多用于設(shè)計(jì)真菌通用引物，比較成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9等；后者則根據(jù)兩個相對變異的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1和ITS2），或特異基因設(shè)計(jì)而成，直接鑒定至種，常用引物有ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等。

Turenne[1]等采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增種特異性ITS-2，結(jié)果證明對獲自血液和組織的致病性真菌種水平上的區(qū)分有極好的效果。有國外學(xué)者用多重PCR測定法鑒定口腔念珠菌屬，采用引物ITS1，ITS2，CA3和CA4進(jìn)行檢測，結(jié)果能準(zhǔn)確檢測出所有樣本菌，比培養(yǎng)法準(zhǔn)確。說明多重PCR是一種檢測假絲酵母屬的快速方法[2]。

2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷多態(tài)性分析(PCR-RFLP)

又稱限制性內(nèi)切酶分析（REA），是指用限制性內(nèi)切酶將DNA在特定的核苷酸序列上切割，由于不同生物個體酶切位點(diǎn)不同，故產(chǎn)生的DNA片段長度呈現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象，根據(jù)這種DNA的多態(tài)性圖譜可進(jìn)行種間和種內(nèi)分型。原則上，只要內(nèi)切酶選擇合適，對所有真菌均能顯示任何分類水平上的多態(tài)性和特異性。

Denning[3]等用該法對肺曲霉病患者體內(nèi)分離的煙曲霉進(jìn)行了DNA分型，結(jié)果提示多種類型的曲霉病可能由同一DNA型的煙曲霉引起，并且發(fā)現(xiàn)致病性煙曲霉菌群的分布與人類生活環(huán)境和自然環(huán)境密切相關(guān)。PCR-RFLP技術(shù)雖然快速、靈敏，但當(dāng)檢測的真菌較多時，由于單種限制性內(nèi)切酶不能區(qū)分所有真菌，需要幾種內(nèi)切酶的聯(lián)合使用，較耗時費(fèi)力。

3 隨機(jī)引物擴(kuò)增 DNA多態(tài)性(RAPD)技術(shù)

又稱任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(arbitrarily primed PCR)，RAPD技術(shù)是利用隨機(jī)合成的單個寡核苷酸為引物（通常為10bp），通過PCR擴(kuò)增靶細(xì)胞基因組DNA片段進(jìn)行多態(tài)性分析，來比較不同個體基因組DNA組成的差異，進(jìn)行基因定位，確定基因型，做出DNA指紋圖等。這一方法適于病原真菌各秩級的分類與鑒定研究，因?yàn)椴≡婢蚪M龐大，目前許多基因操作技術(shù)只能了解其局部的情況，而RAPD卻能對整個基因組序列作大致的了解。RAPD借用的基本方法是PCR技術(shù)，無需模板DNA的任何序列信息，不需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切與測序，無需DNA探針，不涉及Southern雜交、放射自顯影或其他技術(shù)，操作步驟少，實(shí)驗(yàn)周期短，能在較短的時間內(nèi)篩選大量樣品。但其重復(fù)性和特異性往往受反應(yīng)條件的制約。該法可以在未知靶DNA序列的情況下進(jìn)行，特別適用于分子生物學(xué)特征不明確或不了解基因組DNA序列的真菌，因此被廣泛用于酵母菌和絲狀真菌的分類和流行病學(xué)研究。

4 DNA序列分析

DNA序列分析能夠獲得DNA分子變異最本質(zhì)、最可靠的信息，對于了解基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)及分子進(jìn)化等具有重要意義。以DNA為對象的研究均是建立在基因序列差異的基礎(chǔ)上，所以DNA序列分析是分子生物學(xué)研究中最根本的方法。該方法可用于設(shè)計(jì)探針、特異引物等對真菌病進(jìn)行診斷。

真菌基因組中編碼核糖體的基因有4種:18SrDNA、5.8SrDNA、28SrDNA、5SrDNA[4]。包括18 SrDNA入與5.8SrDNA間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal-transcribed spacer-1,ITS-1)，5.8SrDNA與28SrDNA間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal-transcribed spacer-1，ITS-2)。一般編碼區(qū)的序列較保守，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)化較大，在一個屬內(nèi)不同種間變異較大，對鑒定真菌菌種是有價值的。選擇rDNA的ITS區(qū)域是當(dāng)前進(jìn)行種間分類和種系發(fā)生關(guān)系最可靠的編碼區(qū)。

Makimura[5]根據(jù)ITS的序列分析建立了種系發(fā)生樹，將毛癬菌屬分為3群，并指出過去對皮膚癬菌的分類過細(xì)，而以種系發(fā)生關(guān)系的基因型劃分與傳統(tǒng)的分類方法有很大的區(qū)別，需要大量的進(jìn)一步的研究來統(tǒng)一種系發(fā)生關(guān)系的基因型劃分。然而，盡管測序可獲得最準(zhǔn)確最可靠的分類資料，但此技術(shù)對DNA的量和純度要求較高，儀器設(shè)備價格昂貴，操作技術(shù)要求高，限制了它在醫(yī)學(xué)真菌中的應(yīng)用。

5 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析

單鏈構(gòu)象多態(tài)性是利用保守區(qū)的序列作為引物，以PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的DNA片段變性，使其解鏈成為單鏈DNA，在一定條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，DNA上微小的堿基差異即可形成不同的DNA構(gòu)象，在凝膠上的遷移率亦不同，反映出單鏈DNA片段的多態(tài)性。

Kumar等從曲霉病、念珠菌病、角膜炎和皮膚指甲感染病人中分離得到的菌株，用PCR-SSCP對其rRNA的大亞基（LSU）和小亞基（SSU）進(jìn)行放大和分析，由于使用了小亞基和大亞基特異引物，結(jié)果鑒定出各種菌屬。這表明SSCP可以用來區(qū)別真菌到屬的水平。

近年來，SSCP法對白念珠菌序列變異進(jìn)行的檢測結(jié)果表明，在DNA多個位點(diǎn)已能夠檢測到SSCPs，并且被序列測定結(jié)果證實(shí)。由于使用了基因位點(diǎn)特異的引物，故檢測到的等位基因除可用于分類鑒定，還可通過測序了解各多態(tài)性的分子基礎(chǔ)。此外，SSCP法還可用于真菌的基因分型等。

6 電泳核型（EK）分析

電泳核型是指細(xì)胞中的染色體在一定電場作用下，在固體包埋物中的排列情況，反映了染色體大小、數(shù)目和形狀的差異。由于各分類水平上不同分類單位的染色體總會存在一定的差異，因此其EK必然呈現(xiàn)多態(tài)性。

EK分析的多態(tài)性明顯，分辨率較高，電泳條件穩(wěn)定時結(jié)果的重復(fù)性好。但有多種因素可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如電泳緩沖液的離子濃度、電泳溫度、凝膠硬度、脈沖時間、電壓等等。因此這一潛力很大的分類學(xué)方法尚有待于進(jìn)一步從技術(shù)上進(jìn)行完善和改進(jìn)。

7 基因探針技術(shù)

基因探針技術(shù)結(jié)合了酶切圖譜法和分子雜交法，原理是應(yīng)用一段帶有標(biāo)記的特異性核苷酸序列，通過雜交檢測與探針互補(bǔ)的DNA或RNA片段?；蛱结樇夹g(shù)與其他一些分子生物學(xué)技術(shù)（如PCR技術(shù)）結(jié)合，可以具有很高的敏感性。

黃媛等建立了PCR結(jié)合生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)鑒定臨床常見真菌的方法，將9種臨床常見致病真菌鑒定到種。Posteraro使用反向斑點(diǎn)雜交方法快速檢測經(jīng)PCR擴(kuò)增的真菌DNA，其中念珠菌的種屬特異性探針指向ERG11區(qū)域，這項(xiàng)技術(shù)比PCR-RFLP有較大提高，可對痕量核酸樣品進(jìn)行分析，同時基因探針的特異性使實(shí)驗(yàn)結(jié)果很少受到非特異性因素的影響，更適用于臨床微生物檢驗(yàn)。

8 基因芯片技術(shù)

DNA 芯片技術(shù)是用免疫熒光標(biāo)記的待測樣品與有規(guī)律地固定芯片片基上的大量探針按堿基配對原則進(jìn)行雜交，通過激光共聚焦熒光系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行熒光信號強(qiáng)度的比較和檢測的技術(shù)。其突出特點(diǎn)在于高度并行性、多樣性、微型化和自動化。將不同屬種真菌的特異性DNA標(biāo)記后制成DNA芯片，將致病真菌DNA與DNA芯片雜交就可得到屬種特異性圖譜，通過這種圖譜的比較和分析，就可得出致病菌的DNA信息，進(jìn)而可對其進(jìn)行鑒定。

黃愛華以5.8srDNA與28srDNA間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2為靶標(biāo)，針對待檢的臨床常見致病真菌念珠菌屬、曲霉屬、皮膚癬菌等設(shè)計(jì)合成一系列寡核苷酸探針，制成寡核苷酸芯片。待檢真菌DNA經(jīng)通用引物擴(kuò)增標(biāo)記后，與芯片雜交，對雜交圖譜分析歸納，得到一套種特異性的典型雜交圖譜。結(jié)果表明，該研究建立的基因芯片技術(shù)可以有效地區(qū)分20種臨床常見致病真菌，收集從臨床分離的84株致病真菌菌株對基因芯片進(jìn)行試用，結(jié)果顯示基因芯片的鑒定結(jié)果與常規(guī)鑒定方法的鑒定結(jié)果不一致。結(jié)論為這項(xiàng)技術(shù)的建立可以穩(wěn)定、特異性地實(shí)現(xiàn)臨床常見致病真菌的高通量鑒定，為進(jìn)一步檢測研究奠定了基礎(chǔ)。