結(jié)核分枝桿菌抗原MPT51及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

彭 超,王洪海

(1復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200433; 2江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

結(jié)核分枝桿菌抗原MPT51及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

彭 超1,2,王洪海13

(1復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200433; 2江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

結(jié)核分枝桿菌;MPT51蛋白

近年來,結(jié)核病的發(fā)病率有升高趨勢,是人體免疫缺陷病毒(H I V)感染患者的主要死因。結(jié)核病的病原菌主要為結(jié)核分枝桿菌,隨著多耐藥結(jié)核分枝桿菌和H I V共感染的發(fā)生率增加,迫切需要研制新的疫苗和抗結(jié)核藥物以及可靠的早期診斷方法。結(jié)核分枝桿菌能分泌大量不同種類的免疫原性蛋白,其中MPT51/MPB51是主要分泌性蛋白之一,能結(jié)合纖維結(jié)合素;亦是結(jié)核病診斷和疫苗的候選蛋白之一?，F(xiàn)對MPT51的基礎(chǔ)研究概況及其應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 MPT51的結(jié)構(gòu)組成及特性

1.1 MPT51基因 MPT51基因由mpt51基因編碼、900個(gè)堿基組成,其核苷酸已被克隆。MPT51基因密碼子鄰近Ag85A,但不屬于同一個(gè)操縱子。mpt51基因有自己的啟動區(qū),位于fbpA的下游區(qū),且與Ag85復(fù)合物有40%同源性?？ń槊?BCG)中的MPB51是BCG培養(yǎng)濾液中主要的分泌蛋白之一,由mpb51基因編碼。mpb51基因位于Ag85A下游,距離179 bp,編碼299個(gè)氨基酸,其中33個(gè)氨基酸是信號肽,266個(gè)氨基酸是相對分子質(zhì)量為27 807.37 Da的成熟蛋白。MPB51與Ag85復(fù)合體有37%～43%的同源性,二者有2個(gè)同源性很強(qiáng)的區(qū)域,代表保守的功能域,位于氨基酸端的22PYENLMVPSPS MGRD IPVAFLAGGPHAV2YLLD233和內(nèi)部區(qū)域的1892NNTRVWV2195。189～195區(qū)域同時(shí)亦是MPB51最輸水區(qū)域、Ag85復(fù)合物組成部分和FN結(jié)合位點(diǎn)。

1.2 MPT51蛋白 MPT51蛋白相對分子質(zhì)量為27 kD,是結(jié)核分枝桿菌在生長過程中分泌至細(xì)胞外的主要蛋白之一,約占細(xì)胞外蛋白的15%。其在胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞表面以三聚體形式存在[1],與Ag85復(fù)合物有交叉反應(yīng),屬于同一個(gè)分泌蛋白家族。在培養(yǎng)濾液中MPT51和Ag85復(fù)合物比例是1∶3,二者既有相同又有不同的抗原決定基,在結(jié)核桿菌細(xì)胞中發(fā)揮不同作用。

MPT51蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分辨率為1.7!,與Ag85復(fù)合物中的Ag85B和Ag85C一樣,折疊成α/β水解酶。但MPT51蛋白不含有分支酰基轉(zhuǎn)移酶的催化三聯(lián)體(Ser2His2 Glu),且缺少α,α′2海藻糖單霉菌酸酯結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn),因此MPT51蛋白無分支?；D(zhuǎn)移酶的功能。MPT51蛋白可能是一類新的非催化性的α/β水解酶,其結(jié)構(gòu)類似于某些整合素與糖結(jié)合蛋白,因此MPT51蛋白可能在宿主組織黏附上有一定作用,其配體可能包括了血清蛋白纖維結(jié)合素(FN,存在于血漿和組織中的相對高分子質(zhì)量糖蛋白,在細(xì)胞發(fā)育、能動性、粘連、吞噬作用和損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)等方面起重要作用)和小分子糖。Xolalpa等[2]研究發(fā)現(xiàn), MPT51蛋白具有結(jié)合和激活人的纖溶酶原產(chǎn)生纖維蛋白溶酶(可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜如層粘連蛋白和纖維結(jié)合素,并間接活化基質(zhì)金屬蛋白酶和彈性蛋白酶)的作用,此可能與結(jié)核分枝桿菌的侵入散播和造成組織損傷有關(guān)。

2 MPT51的臨床應(yīng)用

2.1 MPT51在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用 MPT51是結(jié)核診斷的潛在生物標(biāo)識物。Ramalingam等報(bào)道,MPT51對175例治療前痰涂片和培養(yǎng)陽性結(jié)核患者診斷中的敏感性和特異性分別為71%和95%。Bethunaickan等[6]研究發(fā)現(xiàn),痰涂片和培養(yǎng)陽性結(jié)核患者的血清抗MPT51的IgG、IgA和Ig M敏感率分別為57%、47%和13%,IgG特異性為98%;IgG+IgA敏感性為71%,特異性為95%;在痰涂片陰性而培養(yǎng)陽性患者中,IgG陽性率為34%;在痰涂片和培養(yǎng)陰性,X射線陽性患者中,IgG陽性率為42%。

Ramalingam等[7]研究發(fā)現(xiàn),MPT51免疫檢測在H I V21陽性患者結(jié)核早期診斷中有重要作用。Singh等[8]用臨床結(jié)核癥狀出現(xiàn)前幾個(gè)月H IV結(jié)核共感染患者的血清分析了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白對于亞臨床診斷的作用,約有12個(gè)抗原被上述血清所識別。其中MPT51和蘋果酸合酶(MS)能被90%的H IV結(jié)核共感染患者血清識別。表明MPT51可用于H IV陽性結(jié)核病高危人群的診斷。Wanchu等[9]研究發(fā)現(xiàn),痰涂片陽性的H IV-TB+和H IV+TB+患者的敏感性約達(dá)80%,特異性>97%。表明MPT51和MS可作為發(fā)病初期亞臨床結(jié)核患者的診斷標(biāo)識物。

當(dāng)MPT51蛋白與其他抗原性蛋白結(jié)合用于診斷時(shí)可提高其敏感性和特異性。MPT51和GlcB能被80%印度人的H IV陰性痰涂片陽性結(jié)核患者的血清抗體所識別。Achkar等[10]研究表明,MPT51和GlcB結(jié)合的血清學(xué)診斷可輔助痰涂片鏡檢作為肺結(jié)核快速診斷方法。Melo Cardoso等[11]報(bào)道,重組蛋白MPT51和GlcB對結(jié)核病患者血清學(xué)診斷的敏感性、特異性分別為75.5%、90.8%。Raja等[12]的實(shí)驗(yàn)分析了結(jié)核分泌蛋白38 kD、30 kD及MPT51、胞質(zhì)蛋白16 kD的血清學(xué)診斷作用。結(jié)果顯示MPT51檢測結(jié)核血清的敏感性和特異性均很高,特別是當(dāng)MPT51、38 kD、30 kD和胞質(zhì)蛋白16 kD蛋白結(jié)合診斷時(shí),敏感性和特異性分別為91%和96%。

2.2 MPT51在結(jié)核病疫苗研制中的應(yīng)用 基因疫苗是疫苗研制的第三次革命。MPT51能結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的FN,在宿主組織附著和毒力方面有重要作用。Ana Paula Junqueira2Kipnis小組研究發(fā)現(xiàn),感染了結(jié)核桿菌的BALB/c小鼠脾臟和肺部的MPT51特異性IFN 2γ+T淋巴細(xì)胞數(shù)量有所增加;對未感染結(jié)核桿菌的BALB/c小鼠接種 rMPT51/F IA和 rMPT51/CpGD2 NA疫苗能增加IFN 2γ+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量;接種 rMPT51/F IA后能誘導(dǎo)MPT51特異性的體液反應(yīng);接種60 d后,肺組織中結(jié)核桿菌的菌落(CFU)數(shù)量減少了2個(gè)log。表明MPT51是具有潛力的DNA疫苗[13]。Yukio Koide小組還研究了編碼巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(M IP21α)和MPT51的DNA疫苗對于誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞的作用。發(fā)現(xiàn)編碼融合蛋白的DNA疫苗較僅編碼MPT51的DNA疫苗能顯著誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更多的抗原特異性T細(xì)胞。編碼M IP21α抗原的融合蛋白DNA疫苗能通過趨化因子受體有效遞呈給抗原遞呈細(xì)胞,并誘導(dǎo)更高水平的抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[14]。

由于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.M.)能在專職抗原遞呈細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)內(nèi)逃離吞噬溶酶體,在細(xì)胞質(zhì)中存活并繁殖,還可誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng),因此可將外源性抗原的DNA引入L.M.構(gòu)建重組L.M.活疫苗。Yukio Koide小組構(gòu)建了攜帶Ag85A、Ag85B、MPB/MPT51真核表達(dá)質(zhì)粒的自毀型L.M.,用該細(xì)菌重組體感染可誘導(dǎo)這些基因在小鼠巨噬細(xì)胞株J774A.1中的表達(dá)。C57BL/6小鼠腹膜內(nèi)免疫此細(xì)菌重組體能誘導(dǎo)PPD特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)如腳跟反應(yīng)、脾細(xì)胞增殖反應(yīng)、脾細(xì)胞IFN γ2的分泌等,顯示出此細(xì)菌重組體抗結(jié)核感染的效果。另有研究發(fā)現(xiàn),靜脈免疫此重組疫苗的BALB/c小鼠免疫保護(hù)反應(yīng)強(qiáng)于BCG。Yukio Koide小組還用慢性病毒作為載體。研究了MPT51作為疫苗的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)免疫改良后攜帶MPT51基因的第三代慢性病毒疫苗2周后,能誘導(dǎo)縱膈淋巴結(jié)產(chǎn)生MPT51特異的T細(xì)胞。此疫苗在肺部能產(chǎn)生MPT51特異性記憶細(xì)胞,但在淋巴結(jié)中不能。此外,MPT51慢性病毒疫苗氣管內(nèi)免疫能顯著降低結(jié)核桿菌在肺部的數(shù)量。

綜上所述,MPT51是結(jié)核分枝桿菌主要的分泌蛋白和重要保護(hù)性抗原之一,在結(jié)核病診斷和新型疫苗研制方面具有重要價(jià)值。

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國家十一五重大傳染病專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2008ZX10003005)。

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