脂肪源干細(xì)胞的特性及其在骨科組織修復(fù)中的應(yīng)用

黃德清,馮燕茹

(天津市第三醫(yī)院骨科,天津 300250)

多年來,對于成體干細(xì)胞的研究多集中在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BSCs)。但骨髓來源有限,抽取時有一定的并發(fā)癥,所得干細(xì)胞數(shù)量少[1,2]。近年來,脂肪組織來源的干細(xì)胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,ASCs)引起了人們越來越多的關(guān)注。ASCs是一種中胚層來源的細(xì)胞,最早從抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中分離培養(yǎng),并證實為多能干細(xì)胞;在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等定向分化,因而,其在骨科組織修復(fù)中的作用日益受到人們的重視 ,相關(guān)研究日見增多[2～4]。

1 脂肪干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

ASC的培養(yǎng)和分化方法均借鑒了以往 BSC的研究方法。通常采用經(jīng)典培養(yǎng)液加 10%～20%的胎牛血清對 ASC進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增[2～4]。常用的方法是將剪碎的脂肪組織消化離心,傾去上層脂肪及上清,獲得基質(zhì)血管層,將其收集到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),除去未貼壁的紅細(xì)胞和殘渣,貼壁的細(xì)胞生長至融合后傳代,傳代后的細(xì)胞稱為 ASCs。剛貼壁的 ASCs呈圓形、紡錘形或梭形,細(xì)胞核居中,可出現(xiàn)雙核或多核。傳代后圓球形細(xì)胞減少,大部分為紡錘形或梭形。隨著傳代次數(shù)增加,細(xì)胞形態(tài)、排列趨于一致。在分化能力上,ASCs可以分化成各種中胚層來源的細(xì)胞系,如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等,而這些細(xì)胞系也正是BSCs的分化方向[2,5]。

2 脂肪干細(xì)胞特征性表面標(biāo)記物的表達(dá)

ASCs在形態(tài)上與 BSCs相似,因此無法從形態(tài)學(xué)上對兩者加以鑒別。同時,ASC與 BSC還具有相似的分化表型[2,3,5]。有文獻(xiàn)分析比較了 BSC與 ASC的表面標(biāo)記物,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均能夠表達(dá) CD29、CD44、CD105、CD49b和CD49e,均不能夠表達(dá) CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD133;但二者在表型上也有差別,ASC表達(dá) CD49 d,肯定不表達(dá) CD106,而 BSC正相反,肯定表達(dá) CD106,而不表達(dá)CD49 d。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞存在的微環(huán)境及細(xì)胞具體功能會影響其免疫表型的表達(dá),如 CD106在 BSC和造血干細(xì)胞的相互作用中起重要作用,而 ASCs中 CD106的陰性表達(dá)則與其處于非造血組織的特點相一致[2,3]。

3 脂肪干細(xì)胞在骨科組織修復(fù)中的應(yīng)用

3.1 促進(jìn)軟骨修復(fù) ASC在成軟骨培養(yǎng)基(chondrogenic medium,CM)中可以定向分化為軟骨細(xì)胞[6～9]。CM中通常添加轉(zhuǎn)化生長因子-β、地塞米松和抗壞血酸。成軟骨分化成功的標(biāo)志是典型基因的表達(dá)和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的出現(xiàn),如 Sox-9、Ⅱ型膠原、可聚蛋白多糖、雙糖鏈蛋白多糖、核心蛋白聚糖、硫酸軟骨素和軟骨低聚基質(zhì)蛋白。 Winter等[8]用CM同時培養(yǎng) ASCs和 BSCs,結(jié)果表明兩者都能向軟骨方向分化,阿爾新蘭染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色均呈陽性,但培養(yǎng) 2周以后發(fā)現(xiàn) ASCs不如 BSCs分化的完全。有學(xué)者將ASCs進(jìn)行高密度培養(yǎng),用 CM誘導(dǎo)后植入纖維蛋白膠支架,用其修復(fù)軟骨缺損,組織學(xué)檢查結(jié)果表明再生組織為透明軟骨。另一項研究在小鼠體內(nèi)制備骨、軟骨缺損的模型,并植入ASCs進(jìn)行修復(fù),結(jié)果骨、軟骨缺損均成功修復(fù),并且 ASC修復(fù)的骨、軟骨缺損的效果優(yōu)于自體骨、軟骨移植,而且在每個隨訪檢查點,ASCs植入組的軟骨修復(fù)參數(shù) Pineda評分都高于自體軟骨移植[2]。

3.2 促進(jìn)骨骼修復(fù) 用于誘導(dǎo)成骨分化的培養(yǎng)基中添加有維生素 C、地塞米松、β-磷酸甘油,這些化學(xué)物質(zhì)被認(rèn)為是誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)基,被稱為成骨培養(yǎng)基(osteogenic medium,OM)[10～12]。 ASCs在 OM中誘導(dǎo)后可出現(xiàn)成骨分化,可見磷酸鈣礦化的細(xì)胞外基質(zhì)、骨鈣素、堿性磷酸酶、骨橋蛋白、I型膠原和成骨轉(zhuǎn)錄因子基因,如 Runx2和 OSX的表達(dá)。ASCs在 OM中體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后第 7天,這些細(xì)胞開始分泌出島狀的細(xì)胞外基質(zhì);2周后堿性磷酸酶染色陽性并形成礦化結(jié)節(jié);第 2～4周,培養(yǎng)孔中鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)的量明顯增加。 ASCs向成骨細(xì)胞分化的能力可以維持相當(dāng)長的時間,其表達(dá)堿性磷酸酶的活性可達(dá)培養(yǎng)后的175 d。將小鼠 ASC在 OM中培養(yǎng)幾代后,細(xì)胞表面形成突起,形態(tài)類似于體內(nèi)的成骨細(xì)胞,茜素紅染色呈陽性。研究人員進(jìn)一步將此種誘導(dǎo)所得的小鼠 ASC作為種子細(xì)胞植入聚羥基乙酸支架中,再移植到小鼠體內(nèi),經(jīng)過 4～8周時間,通過免疫組化分析,可以觀察到植入部位成骨過程的發(fā)生。經(jīng)成骨誘導(dǎo)的 ASC植入聚乳酸支架修復(fù)大鼠顱骨缺損,與對照組相比,有更多的骨組織形成[11]。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BM P-2)基因的ASCs更易分化成成骨細(xì)胞,并可更快啟動細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化。在大鼠體內(nèi)制作后外側(cè)脊柱融合模型,將 BM P-2轉(zhuǎn)染后的 ASCs植入Ⅰ型膠原支架上,再移植到大鼠脊柱需融合部位,成功實現(xiàn)了脊柱融合[12]。有學(xué)者在臨床上用自體 ASC與髂骨及纖維蛋白膠等結(jié)合,修復(fù) 1例 7歲女孩的大面積顱骨缺損,術(shù)后 3個月,CT掃描顯示原顱骨缺損基本愈合。說明臨床上使用自體 ASC是安全的,而且能促進(jìn)大面積、難治性骨缺損的修復(fù)[13]。

3.3 促進(jìn)椎間盤修復(fù) 因為椎間盤源性下腰痛發(fā)病率高,用干細(xì)胞修復(fù)退變的椎間盤引起了人們很大的興趣[14,15]。有作者將兔腹股溝部來源的 ASCs單獨與椎間盤髓核或纖維環(huán)共同培養(yǎng),結(jié)果表明,與其他培養(yǎng)條件相比,與髓核一起培養(yǎng)的 ASCsⅡ型膠原和核心蛋白聚糖基因表達(dá)增加。這表明髓核細(xì)胞釋放的可溶性因子可引導(dǎo) ASCs向髓核樣細(xì)胞分化。自體 ASCs無論用生長因子誘導(dǎo),以及黏附于基質(zhì)材料上與否,注射入椎間盤組織后,均顯示其有促進(jìn)椎間盤組織修復(fù)的作用。有作者將 ASC在體外用綠色熒光基因轉(zhuǎn)染后,植入大鼠的腰椎間隙內(nèi),用無損傷活體成像系統(tǒng)成功檢測到熒光基因的表達(dá),術(shù)后 7d時表達(dá)達(dá)高峰,14 d后開始減弱,ASCs在椎間隙內(nèi)存活達(dá) 28d以上[15]。

3.4 促進(jìn)肌腱修復(fù) ASCs在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為肌腱細(xì)胞,植入肌腱損傷處可明顯促進(jìn)肌腱愈合[2,16,17]。有作者用膠原酶制作馬的肌腱損傷模型,然后在肌腱損傷周圍注入自體 ASCs治療,ASCs治療肌腱組的生物力學(xué)測試及組織學(xué)檢查結(jié)果均優(yōu)于對照組,軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COM P)基因表達(dá)增加。COM P結(jié)合到復(fù)合膠原纖維上,可促進(jìn)膠原的形成和成熟[16]。 Huang等[17]將 ASCs用攜帶綠色熒光基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后,植入大鼠跟腱缺損處,術(shù)后 0～28 d用活體無損傷成像系統(tǒng)在跟腱修復(fù)處檢測到綠色熒光的表達(dá);術(shù)后 28 d,修復(fù)段跟腱標(biāo)本的冰凍切片用免疫熒光標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下,在肌腱修復(fù)段檢測到大量熒光標(biāo)記的 ASCs,表明ASCs可用于肌腱損傷的修復(fù)。

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