副豬嗜血桿菌病的診斷與防治

鄭其升，何家惠，侯繼波

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014）

副豬嗜血桿菌（HPS）是豬上呼吸道正常菌群中的一種常見細菌，但在特定條件下可以侵入機體并引起嚴重的全身性疾病。本病通過直接接觸、呼吸道及消化道等途徑傳播，以5～8周齡的仔豬最易感，其他年齡段的青年豬、母豬及種公豬亦可感染，有的以隱性感染或慢性跛行為重。近幾年來，我國副豬嗜血桿菌在養(yǎng)豬場引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，特別是規(guī)?；i場在受到藍耳病、圓環(huán)病毒等感染之后豬群免疫功能下降時，副豬嗜血桿菌病伺機暴發(fā)，導致較嚴重的經(jīng)濟損失。為了加強對該病的防治，筆者對本病的診斷防治研究綜述如下。

一、流行病學

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，能從健康動物的鼻腔、鼻氣管分泌物和扁桃體中分離到。副豬嗜血桿菌只感染豬，有很強的宿主特異性。病菌寄居于感染豬的呼吸道，在應(yīng)激情況下各年齡豬群都易發(fā)病，飼養(yǎng)環(huán)境不良、斷奶、轉(zhuǎn)群、混群或運輸也是常見誘因。因此，自1910年Glasser報道以來，本病成為一種全世界廣泛分布的疫病。

副豬嗜血桿菌病的主要傳播途徑是空氣、豬與豬之間的接觸或通過污染排泄物，病豬和帶菌豬是本病的主要傳染源，未免疫的豬場或特別健康的豬群(如SPF豬)最容易受到侵襲。首次感染本菌的豬癥狀可能很嚴重，已經(jīng)免疫的豬只被感染時表現(xiàn)非典型癥狀。在肺炎中，副豬嗜血桿菌被假定為一種隨機入侵的次要病原，是一種典型的“機會主義”病原，只在與其它病毒或細菌協(xié)同時引發(fā)疾病。該病常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒引起的病毒病及豬氣喘病并發(fā)。研究表明PRRSV感染的豬肺中，副豬嗜血桿菌的檢出率為50%左右，顯示副豬嗜血桿菌病很可能是PRRSV感染后的二次性病原。

二、臨床癥狀

本病急性病例往往先發(fā)生于膘情良好的豬，表現(xiàn)為發(fā)熱（40.5℃～42.0℃）、病初貧血、呼吸困難、耳稍發(fā)紫、眼結(jié)膜發(fā)紺、眼瞼皮下水腫，不喜運動，精神沉郁、食欲下降或不食，體表皮膚發(fā)紅或蒼白，行走緩慢或不愿站立，腕關(guān)節(jié)、跗關(guān)節(jié)腫大，共濟失調(diào)，臨死前側(cè)臥或四肢呈劃水樣，有時也會無明顯癥狀而突然死亡。

慢性病例多見于保育豬，主要表現(xiàn)為食欲下降、咳嗽、呼吸困難、被毛粗亂，四肢無力或跛行，生長不良，甚至衰竭而死亡。耐過的豬只常發(fā)展成慢性型。

三、病理變化

急性病例尸體剖檢可見多發(fā)性纖維素性或漿液性、纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。主要表現(xiàn)為胸膜炎、腹膜炎、腦膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎。多見纖維素性或漿液性滲出，胸水、腹水增多，有時肺臟發(fā)生粘連、腫脹、出血、瘀血。胸腔內(nèi)有大量淡紅色液體及纖維素性滲出物凝塊；心包膜與心臟粘連，心包內(nèi)常有干酪樣甚至豆腐渣樣滲出物，使心外膜與心臟粘連在一起，形成“絨毛心”，是本病最典型的病理變化，通常出現(xiàn)在病程較長的病例；肺臟出血，表面覆蓋大量纖維素性滲出物并與胸壁粘連，多數(shù)為間質(zhì)性肺炎，部分有對稱性肉樣變化，且有大量小化膿灶，外包有結(jié)締組織；化膿性或纖維素性腹膜炎，腹腔積液或內(nèi)臟器官粘連;全身淋巴結(jié)腫大，暗紅色，切面呈大理石花紋；關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量粘液性纖維蛋白滲出物，以跗、腕關(guān)節(jié)居多；腎、十二指腸均有出血點，回盲口附近有輪層扣狀潰瘍；脾出血性梗死。尤以心包炎和胸膜肺炎的發(fā)生率為最高。

慢性病例最特殊的病理變化是纖維性化膿性支氣管肺炎，兼有纖維性胸膜炎。病灶往往出現(xiàn)在肺臟背部，呈圓形，有明顯的界限。通常在肺的橫膈膜葉較易出現(xiàn)病灶。早期組織學病變包括壞死、出血，嗜中性白細胞浸潤，巨嗜細胞和血小板激活，血管內(nèi)血栓形成；后期則主要以巨嗜細胞浸潤為特征。

四、診斷

(一)細菌分離鑒定采集處于急性期病豬（在使用抗菌藥物之前）受損漿膜面上的炎性物質(zhì)如腦脊髓液，心包液及關(guān)節(jié)液等接種于含有NAD（煙酰胺酰嘌呤二核苷酸）的培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，可見一些小而透明的菌落；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)沒有溶血環(huán)；在顯微鏡下可見到單個的從球桿狀到細長，甚至絲狀等多種不同形態(tài)的菌體，通常具有莢膜；該菌革蘭氏染色呈陰性；生化試驗表明，該菌脲酶陰性，氧化酶陰性，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖等，從以上試驗結(jié)果基本可以診斷該菌為副豬嗜血桿菌。

細菌的分離鑒定對確診是必要的，但往往不能成功，這是因為副豬嗜血桿菌十分嬌嫩，相對于樣品中可能同時存在的其它細菌，其生長需要難以滿足，因此不能確認采集來的標本中究竟是否存在副豬嗜血桿菌。正因為如此，許多研究對分離鑒定診斷副豬嗜血桿菌病的方法進行了改進，歸納起來有以下幾點：

首先，在同一豬群中出現(xiàn)副豬嗜血桿菌的幾個菌株或血清型并非少見，甚至在單個豬的不同標本中也可發(fā)現(xiàn)不同的菌株或血清型，簡單的分離鑒定難以確定引起致病的主要菌株，從全身各處或大損傷點的分離是唯一能保證所分離出來的細菌在病程中發(fā)揮作用的前提，細菌分離培養(yǎng)最好選擇漿膜表面物質(zhì)或滲出的腦脊髓液及心臟血液，即使病變輕微或不明顯也要這樣做。

其次，為了消除臨床上抗菌素的使用對細菌分離的影響，采集病料時應(yīng)當選擇處于疾病急性期的豬并在應(yīng)用抗菌素之前進行細菌的分離鑒定。

第三，由于副豬嗜血桿菌十分脆弱，放置時間過長的病料往往難以分離出副豬嗜血桿菌，因此病料可以在送到診斷實驗室之前接種到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，再從這種液體培養(yǎng)基中獲得副豬嗜血桿菌。

第四，可對分離方法以及培養(yǎng)方法進行改進: 如使用含抗菌素的選擇性培養(yǎng)基，或運用特殊的稀釋技術(shù)以提高副豬嗜血桿菌的分離率，用脫纖維蛋白鮮血和胰蛋白胨鮮血瓊脂培養(yǎng)基可以提高生長速度。

(二)血清學檢測補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗已用于檢測副豬嗜血桿菌的抗體。在急性病例的臨床經(jīng)過中，大約1周出現(xiàn)循環(huán)補體結(jié)合抗體，相同的特異性抗體滴度在攻毒后得到一致證實，但發(fā)現(xiàn)各種血清型之間具有交叉反應(yīng)。Takahashi等在一項疫苗試驗中采用了補體結(jié)合試驗檢測抗體滴度，在二免后19日觀察到陽性的抗體滴度，但沒有對交叉反應(yīng)作出研究。對使用超聲波破碎的細菌或煮沸的細菌作為包被抗原致敏綿羊紅細胞建立的間接血凝試驗的研究，以及對使用煮沸的細菌菌液上清或經(jīng)過透析的熱酚水提取物(脂多糖，LPS)作為包被抗原建立的ELISA的研究表明，這些診斷方法不穩(wěn)定并且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，甚至當免疫后的動物攻毒得到完全保護時也是如此，這些方法用于評估副豬嗜血桿菌的保護性免疫反應(yīng)不可靠。Solnoa-Agullar采用福爾馬林滅活的全細菌作為包被抗原用于EuSA檢測并研究了疫苗免疫后的母源抗體滴度和仔豬的體液免疫反應(yīng)，表明免疫母豬所產(chǎn)的仔豬早在5日齡即可檢測出母源抗體。

近年來，IHA經(jīng)過不斷改進后已廣泛應(yīng)用于檢測血清中各種病原的抗體，與ELISA相比，IHA操作過程簡便、節(jié)省時間且不需要特殊儀器。將副豬嗜血桿菌經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化靴酸化紅細胞，建立的檢測副豬嗜血桿菌抗體的有效檢測技術(shù)，采用該法對副豬嗜血桿菌15種血清型標準血清的檢測結(jié)果都為陽性。對豬瘟、口蹄疫、圓環(huán)病毒、細小病毒、豬偽狂犬、豬繁殖與呼吸綜合征、豬氣喘病、豬鏈球菌、豬肺疫巴氏桿菌、豬傳染性萎縮性鼻炎及胸膜肺炎等病原的標準陽性血清的檢測結(jié)果全為陰性，具有良好的特異性。

（三）分子生物學檢測

1.PCR檢測。根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計引物建立的PCR診斷方法可進一步提高從臨床樣品中檢測副豬嗜血桿菌的靈敏性，其敏感性遠遠高于常規(guī)的細菌分離方法。該PCR方法主要應(yīng)用于確定全身感染副豬嗜血桿菌在發(fā)病豬場的流行情況，通過無菌拭子采集的樣品可在24 h內(nèi)得出結(jié)果。PCR方法具有高度特異性，其最低檢測量為102CFU/ml。以從豬器官中經(jīng)常分離到的15種其它細菌抽提的DNA做模板時，結(jié)果全為陰性。但當以吲哚放線桿菌DNA作為模板時可以觀察到一條弱帶，由于吲哚放線桿菌主要出現(xiàn)于常規(guī)飼養(yǎng)豬的上呼吸道，因此，只有那些自全身性部位采集的樣品用于PCR檢測才具有診斷價值。目前，國外已有了幾種檢測HPS種特異性的PCR方法，并且開始研究用PCR方法鑒定某種血清型菌株，并積極完善和建立能直接檢驗臨床樣品的副豬嗜血桿菌種特異性和各地血清型特異性的PCR方法。

2.限制性片段長度多態(tài)性?，F(xiàn)已建立一種聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）試驗，作為副豬嗜血桿菌流行病學研究分型的另一種方法。以PCRRFLP法對編碼轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白的基因htpA進行分析，從而對副豬嗜血桿菌進行分型，結(jié)果表明15種副豬嗜血桿菌標準菌株產(chǎn)生12種不同的圖譜。這些標準菌株中，血清型5、12、14和15具有共同的酶切圖譜。Rdeondo等對101株副豬嗜血桿菌現(xiàn)場分離株的分型表現(xiàn)出33種RFLP圖譜，其中有10株細菌與標準菌株產(chǎn)生的圖譜一致。用瓊脂擴散試驗對66個菌株進行血清型分型，發(fā)現(xiàn)其分屬25種RFLP群，表明在相同的血清型內(nèi)具有遺傳多樣性，而27株不能分型的菌株分屬14種不同的RFLP群。血清型與RFLP之間沒有相關(guān)性。

3.重復序列PCR。重復序列PCR已被用于描述副豬嗜血桿菌分離菌株的多樣性以及副豬嗜血桿菌感染的流行病學研究。重復序列PCR的原理是：設(shè)計與散在的重復序列互補的外向寡核苷酸引物進行PCR，對這些重復序列之間相應(yīng)的不同長短DNA序列進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳后即可形成具有菌株特異性的DNA指紋圖譜。這些散在的重復序列中，有相當多的重復序列保存在不同種屬的細菌，因此同一對引物可應(yīng)用于多種不同的細菌。由于不同細菌菌株重復序列之間的DNA序列長短不同，散在的重復序列探針和基因組指紋圖譜可用于區(qū)分不同的細菌。

4.原位雜交。Jung等用原位雜交在自然感染豬檢測副豬嗜血桿菌，在原位雜交中用非放射性的地高辛標記的DNA探針。他們選擇了20頭發(fā)病豬，用PCR擴增16S rRNA產(chǎn)生821bp的DNA片段作為探針，將組織（肺、心、脾和肝臟）用福爾馬林固定石蠟包埋后檢測雜交信號，發(fā)現(xiàn)鑒定含副豬嗜血桿菌的細胞有時比較困難，但觀察HE染色的相鄰部分可以確定陽性細胞，包括含副豬嗜血桿菌的巨噬細胞（大的卵圓形細胞核和豐富的細胞質(zhì)）和嗜中性細胞（二分葉的細胞核），該法具有病理觀察和病原檢測的雙重作用。

五、防制

嚴格消毒，搞好環(huán)境衛(wèi)生做好環(huán)境消毒工作，以殺滅豬舍內(nèi)的細菌和病毒，特別是與本病發(fā)生有極大關(guān)系的支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒等。可用2%氫氧化鈉水溶液噴灑豬圈地面和墻壁，2 h后用清水沖凈，再用百毒速殺噴霧消毒，連續(xù)噴霧消毒4～5 d。

在飼養(yǎng)管理過程中實行嚴格的全進全出制，杜絕將各生產(chǎn)階段的豬或不同來源的豬混群飼養(yǎng)。其次在疾病流行期間有條件的豬場仔豬斷奶時可先分群飼養(yǎng)，再合群，對合群的一定要嚴格把關(guān)，把病豬集中隔離在同一豬舍。另外在飼養(yǎng)過程中注意保溫和溫差的變化。最后在豬群斷奶、轉(zhuǎn)群、混群或運輸前后可在飲水中加一些抗應(yīng)激的藥物如維生素C等，同時在料中添加藥物，并給以全價飼料、放在溫暖、干燥、通風良好的豬舍內(nèi)，給充足的飲水以防止該病的發(fā)生。

加強免疫接種，副豬嗜血桿菌現(xiàn)已確定有15種血清型，各型的致病力都不相同，因此選擇疫苗時要注意所選疫苗菌株血清型是否與當?shù)亓餍械木暄逍鸵恢隆Ｎ覈壳傲餍械母必i嗜血桿菌主要為血清4型和5型，免疫含有血清4型和5型的雙價菌苗能顯著降低血清13型和14型菌株感染后的病變程度和病死率(因為不同血清型之間存在一些共同抗原決定族，并可誘導產(chǎn)生交叉保護)。在副豬嗜血桿菌病嚴重的豬場，必要時可對豬群進行免疫。后備母豬產(chǎn)前40 d初免，產(chǎn)前20 d二免；經(jīng)產(chǎn)豬產(chǎn)前30 d免疫1次即可。受本病嚴重威脅的豬場，小豬也要進行免疫，根據(jù)豬場發(fā)病日齡推斷免疫時間，仔豬免疫一般安排在7日齡到30日齡內(nèi)進行，1 ml/次，最好初免后過15 d再重復免疫1次，二免距發(fā)病時間要有10 d以上的間隔。

發(fā)病早期，抗生素的使用以降低死亡率和延遲發(fā)病，但是停藥后本病將再度暴發(fā)，大量投藥也會增加藥物殘留和產(chǎn)生抗藥性的風險。在暴發(fā)嚴重的副豬嗜血桿菌病時，抗生素的使用價值不高。目前藥敏試驗表明該菌對磺胺甲基異氟甲砜霉素、頭孢菌素、阿莫西林、氨芐青霉素、喹諾酮類、慶大霉素及增效磺胺，大多數(shù)菌株對紅霉素、四環(huán)素、氨基苷類和林可霉素類有抵抗力。

六、展望

近年來，對副豬嗜血桿菌的病原學、血清學、分子生物學檢測技術(shù)進行大量研究，已建立了副豬嗜血桿菌的快速分離鑒定方法，但許多重要的領(lǐng)域還有待于深入研究。確定和描述可能的毒力因子，闡述獲得保護性免疫的機制，建立一種可以區(qū)分常在菌與全身性感染菌的血清學診斷方法，以及研制廣譜的疫苗等都是對副豬嗜血桿菌的研究需要深入的重要領(lǐng)域。

（略）