Livin基因與腫瘤的研究進(jìn)展

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安 710004)柴春艷 綜述 李雅莉 審校

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apop tosisp rotein,IAP)是近年來(lái)備受矚目的一類蛋白家族,是一類新的獨(dú)立于 Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些 IAPs成員異常高表達(dá)常引起組織凋亡受阻,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過 RT-PCR、Northern blot等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) Livin基因在胎兒發(fā)育過程中的多種組織中有高表達(dá),在大多數(shù)成人組織中(除胎盤外)低表達(dá)或不表達(dá),而在多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞株如黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌和白血病等中均表達(dá)增高[1～6]。表明該基因可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用,并有研究認(rèn)為癌癥患者放化療的耐藥與 Livin基因的表達(dá)水平有關(guān)。 Cmkovic等[7]研究發(fā)現(xiàn) He-la細(xì)胞抵制阿霉素、射線和 TNF誘導(dǎo)的凋亡的機(jī)制在于細(xì)胞內(nèi) Livin基因過表達(dá),用siRN A靶向干擾 Livin的表達(dá)后能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。據(jù)此,Livin基因有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn),是目前腫瘤研究的新熱點(diǎn)。

1 Livin基因的結(jié)構(gòu) Livin(又稱 M L-IAP/KIAP)是于 2000年 Lin等[8]根據(jù) IAPs基因同源序列,在人的胎腎cDN A文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的新成員,當(dāng)時(shí)將其命名為 KI-AP(Kidney inhibitor of apop tosis protein);同年,Vucic等[1]發(fā)現(xiàn)該基因在黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá),并稱其為 M L-IAP(Melanomainhibitor of apop tosispotein);2001年 Kasof等[9]將之命名為 Livin并沿用至今。

Lin等[3]用熒光原位雜交方法確定 Livin基因位于人 20號(hào)染色體 20q13.3區(qū)域,全長(zhǎng) 4.6 kb,包含 7個(gè)外顯子。此外還發(fā)現(xiàn)存在長(zhǎng)約 2.2,2.8和 4.0 kb的轉(zhuǎn)錄子 ,Livin蛋白 N端僅包含一個(gè) BIR結(jié)構(gòu),包含 4個(gè)α螺旋和一個(gè)三股抗平行β片層,與相應(yīng)的氨基酸殘基共同構(gòu)成疏水核心。C端含有一個(gè)RN G環(huán)指結(jié)構(gòu)[2,4],氨基酸殘基 C124,C127,H44及 C151與鋅原子結(jié)合,借以穩(wěn)定整個(gè)重疊結(jié)構(gòu)。 2001年,Ashhab等[10]研究發(fā)現(xiàn) Livin有兩種異構(gòu)體,是同一基因轉(zhuǎn)錄后由于剪切方式的不同而形成的兩種 mRNA亞型,命名為 Livinα和 Livinβ,兩者僅在外顯子 6處有 54個(gè)堿基的不同 ,分別編碼 298個(gè)氨基酸和 280個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。兩種異構(gòu)體蛋白的結(jié)構(gòu)高度相似,均只含有一個(gè) B IR結(jié)構(gòu)域和一個(gè) R ING結(jié)構(gòu)域,在這兩種結(jié)構(gòu)域之間有 18個(gè)氨基酸的差別。但在體外實(shí)驗(yàn)顯示兩種異構(gòu)體具有不同的抗凋亡特性和組織表達(dá):兩者都能抑制由TN F-α誘導(dǎo)的凋亡,但只有 Livinβ能夠阻斷足葉乙甙誘導(dǎo)的凋亡[2];在對(duì)多種實(shí)體腫瘤 Livin表達(dá)的研究中,兩種亞型常同時(shí)表達(dá),但僅有 Livinα在淺表膀胱癌的復(fù)發(fā)早期表達(dá)[2];用siRN A技術(shù)沉默 Hela細(xì)胞中 Livinβ的表達(dá)而不是 Livinα才能夠阻抑細(xì)胞株的生長(zhǎng)[11]。是何原因?qū)е铝诉@樣的差別 ,目前尚無(wú)明確結(jié)論,初步的設(shè)想認(rèn)為在外顯子 6處 Livin α較 Livinβ多出 54個(gè)堿基形成的 18個(gè)氨基酸序列可能形成一定的空間結(jié)構(gòu)而造成明顯的功能差異[12]。但具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入的研究。

2 Livin基因的作用機(jī)制

2.1 Livin與 Caspases蛋白 Livin具有抗凋亡的作用已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)觀察和臨床研究中得到證實(shí),但對(duì)于 Livin在體內(nèi)具體的作用機(jī)制目前尚未完全闡明。目前的研究認(rèn)為它可以作為一種酶抑制劑通過 B IR結(jié)構(gòu)域與凋亡過程中激活的核心物質(zhì) Caspases蛋白如 Caspase-3、Caspase-7等結(jié)合并導(dǎo)致Caspases蛋白的失活和降解。Caspases蛋白是細(xì)胞內(nèi)的天冬酰氨特異酶切的半胱氨酸蛋白酶家族,是介導(dǎo)凋亡的主要因素之一。大多數(shù)刺激物都是通過激活 Caspases蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引起凋亡的。在 Fas/caspase-8誘導(dǎo)的死亡受體途徑中,Livin直接抑制該途徑中的核心 Caspases-3蛋白酶的活性;而在另一條細(xì)胞色素 C/Apof-1作用的線粒體途徑中,Livin也能與Caspase-9前體蛋白及其激活形式結(jié)合或通過阻斷 Caspase-3對(duì) Caspase-9前體蛋白的反饋激活從而產(chǎn)生抗凋亡的作用。但也有學(xué)者在對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人迷惑且自相矛盾的現(xiàn)象[13],Livin在與 Caspase-3、Caspase-7結(jié)合產(chǎn)生抗凋亡作用的同時(shí)也能夠被 Caspase-3和 Caspase-7在特異的 Asp-52位置處裂解,而且通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Livin裂解后的亞單位反而獲得了促進(jìn)凋亡的能力而同時(shí) Caspase-3和Caspase-7的活性也被抑制。這種現(xiàn)象表明 Livin對(duì)于 Caspases蛋白有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,也表明了 Livin結(jié)構(gòu)的完整性是 Livin發(fā)揮抗凋亡作用的前提條件。對(duì)于該現(xiàn)象最近的研究有了一些新觀點(diǎn):Nachmias等[14]發(fā)現(xiàn)完整的 Livin蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)彌散地分布,而裂解后截短的 Livin(Truncated Livin,tLivin)定位于細(xì)胞核周高爾基體。利用突變分析發(fā)現(xiàn)了 tLivin促進(jìn)凋亡的兩個(gè)重要功能區(qū)域—裂解后暴露的氨基末端和RN G結(jié)構(gòu)域,前者決定了 tLivin在核周的定位,并且只有在正確定位后,tLivin的 RNG結(jié)構(gòu)域才能發(fā)揮它促進(jìn)凋亡的功能。

2.2 Livin與 TAK1/JN K1途徑 近年的研究發(fā)現(xiàn) JNK1途徑在 IAPs抗凋亡中發(fā)揮重要作用,是 Livin對(duì)抗 TNF-α和白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)誘導(dǎo)凋亡的一條重要途徑[15].Livin能夠直接結(jié)合轉(zhuǎn)化因子 β激酶(Transforming growthfactor-β-activated kinase,TAK1)來(lái)激活絲裂原激活蛋白 JNK1,T AK1結(jié)合蛋白 (TAK1-binding protein,T AB1)是TAK1的共反應(yīng)子,TAB1本身對(duì) JNK1無(wú)激活作用,但 Livin可與 TAB1結(jié)合進(jìn)一步激活 T AK1。

2.3 其他途徑 還有學(xué)者認(rèn)為具有 RNG結(jié)構(gòu)域的IAPs如 Livin等具有泛素連接酶(Ubiquitin Ligase,E3)的功能[16]。泛素能夠與靶蛋白共價(jià)結(jié)合,導(dǎo)致靶蛋白發(fā)生泛素化,然后再被一種蛋白水解復(fù)合物降解并失去靶蛋白原有的功能。Livin可以作為一種泛素連接酶 ,使其靶蛋白 Caspases發(fā)生泛素化并降解從而抑制細(xì)胞凋亡。Livin作為泛素連接酶還可以導(dǎo)致 Smac/D IABLO蛋白的降解[10]。 Smac(Second mitochondria derived activator of caspases)又 稱 作 DIAB-LO,是IAP家族重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白,是在凋亡信號(hào)的刺激下,由線粒體釋放入胞漿,在胞漿內(nèi)成熟與 IAPs的 B IR端直接結(jié)合而抑制 IAPs的活性。Livin使 Smac蛋白泛素化并降解后可間接阻止 Smac對(duì)抗 XIAP的凋亡抑制作用[17]。在對(duì)其它 IAP蛋白作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn) IAPs還可以通過 N F2 κB激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑、鈣離子結(jié)合蛋白等方式發(fā)揮抗凋亡作用。Livin是否也有類似的作用方式還有待研究進(jìn)一步證實(shí)。

3 Livin基因在腫瘤中的表達(dá)

3.1 泌尿系統(tǒng)腫瘤 Gazzaniga等[6]的研究發(fā)現(xiàn),RTPCR檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞時(shí) Livin-a在 24例正常膀胱組織中不表達(dá),而在 7例(23%)患者中表達(dá),而 Livin-β沒有檢測(cè)到。通過對(duì)基因表達(dá)和復(fù)發(fā)時(shí)間的分析發(fā)現(xiàn),Livin的表達(dá),Bcl-2/Bax的高比率,bcl-XL的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,尤其Livin-a在膀胱癌的復(fù)發(fā)早期時(shí)表達(dá),提示 Livin在淺表性膀胱癌的演變中起一定作用,并且可以作為腫瘤早期復(fù)發(fā)的標(biāo)志。Wagener等[18]應(yīng)用 RT-PCR、免疫印染、免疫組化等技術(shù)對(duì)數(shù)百例腎細(xì)胞癌細(xì)胞和正常腎細(xì)胞進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞和正常腎細(xì)胞中均存在 Livin的表達(dá),且亞型相同,但在腎細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增加。劉賢奎等[19]通過對(duì) 46例膀胱移形細(xì)胞癌患者的研究中也發(fā)現(xiàn),與正常人相比,膀胱移形細(xì)胞癌患者的抗 Livin抗體水平增加非常明顯。Livin在膀胱移形細(xì)胞癌中的過度表達(dá)提示其可作為分子治療膀胱移形細(xì)胞癌的一個(gè)靶點(diǎn)。Kempkensteffen[20]的研究也表明了這一點(diǎn),Livin可作為腎細(xì)胞癌分子治療的一個(gè)靶點(diǎn),而不是評(píng)估預(yù)后的一個(gè)因素。

3.2 呼吸系統(tǒng)腫瘤 Hariu等[17]研究表明 Livin與肺癌有一定的相關(guān)關(guān)系,他們應(yīng)用 RT-PCR方法檢測(cè)到 Livin可在許多肺癌細(xì)胞株和原發(fā)性肺癌組織中呈異常表達(dá),而在正常的肺組織中卻未見表達(dá)。Tanabe等[21]也用 RT-PCR檢測(cè) 38例非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)肺癌組織 Livin的 mRN A表達(dá)情況,并與 15例正常肺組織作對(duì)照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織 Livin mRNA表達(dá)率為 76.3% (29/38);而正常肺組織表達(dá)率分別為 6.7%(1/15)。這一研究結(jié)果顯示 Livin在 NSCLC發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,并且可通過檢測(cè) Livin的表達(dá)情況,有助于肺癌患者的診斷。 Yagihashi等[22]研究還發(fā)現(xiàn):51.3%(19/37)的肺癌患者血清 Livin抗體的檢測(cè)為陽(yáng)性,因此,如能檢測(cè)到 Livin抗體同樣將有助于肺癌患者的診斷。

3.3 黑色素瘤 對(duì) Livin在黑色素瘤治療方面的研究也頗為深入,V ucic等[23]發(fā)現(xiàn) Livin的過度表達(dá)能夠抑制惡性黑色素細(xì)胞發(fā)生凋亡,潛在地促進(jìn)黑色素瘤癌基因的表達(dá)。而且高表達(dá) Livin基因的黑色素瘤細(xì)胞也可以阻斷抗癌藥所致的細(xì)胞凋亡,使其對(duì)化療藥物不敏感;因此,檢測(cè)患者體內(nèi) Livin的表達(dá)率,可指示該患者對(duì)某化療藥物的敏感性[24]。如果能找到一種藥物可以降低 Livin的表達(dá),就可以抑制這種黑色素瘤細(xì)胞的增殖。Puri等[25]研究發(fā)現(xiàn) T-oligos(一種寡肽)就能大大地下調(diào) Livin基因的表達(dá)。這為我們治療惡性黑色素細(xì)胞瘤提供了一種更好的方法。

3.4 消化系統(tǒng)腫瘤 相關(guān)報(bào)道表明,Livin在多種消化系統(tǒng)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。 Ashhab等用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Livin-a和 Livin-β在結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT29M TX、HT29中呈高表達(dá)。黎軍和等[26]通過對(duì) 81例行根治性手術(shù)后的 Dukes’B期的結(jié)直腸癌組織的研究發(fā)現(xiàn)。 Livin在 Dukes’B期結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率為 45.7%,明顯高于正常對(duì)照組的 8.3%(P＜0.05)。Cox多因素分析顯示 Livin陽(yáng)性為 Dukes’B期結(jié)直腸癌獨(dú)立不良預(yù)后因素(P=0.047)。 Yagihashi等[27]通過對(duì)胃腸腫瘤中的 Livin mRN A研究發(fā)現(xiàn),Livin mRNA可在胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC? 1、結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29、肝癌細(xì)胞系(HepG2)等細(xì)胞系中表達(dá),在胰腺癌細(xì)胞系 AsPC-1和結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29表達(dá)較高 ,與 GAPDH mRN A的比值分別為 0.78和 0.42,而在另外 2個(gè)胰腺癌細(xì)胞系(MIA PaCa-2和 BxPC-3)、胃癌細(xì)胞系(M KN-1)和另外 2個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系(LSll80和 SW620)中未檢測(cè)出 Livin mRN A。以上研究表明,檢測(cè) Livin抗原有望成為發(fā)現(xiàn)腫瘤的新方法。

4 Livin與腫瘤治療 Crnkovic-Mertens等[7]利用基因轉(zhuǎn)染和特異性小干擾 RNA(siRNA)技術(shù),在肺癌 SPC-A1細(xì)胞株中建立 Livin異構(gòu)體α和β特異的基因沉默體系,觀察誘導(dǎo) SPC-A1細(xì)胞凋亡效應(yīng)中的不同作用,并用 TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示內(nèi)源性 Livinα和 Livinβ基因沉默后,SPC-A1細(xì)胞克隆形成能力較對(duì)照組顯著下降,促使 SPC-A1細(xì)胞發(fā)生凋亡,表明 Livinα和 Livinβ兩種異構(gòu)體均能作為誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子靶點(diǎn),通過使 Livin基因沉默的靶向誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡可作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段。 Schmollinger等[28]發(fā)現(xiàn) Livin可作為一個(gè)抗原靶點(diǎn)來(lái)治療黑色素瘤,高滴度 IgG抗體可以識(shí)別 Livin并與之結(jié)合,使其失去活性,從而達(dá)到治療黑色素瘤的目的。

由于 Livin在多種腫瘤中高表達(dá),在一些腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá),研究 Livin的作用機(jī)制可為腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后提供重要的理論依據(jù),有望成為腫瘤的標(biāo)志物,可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn),為腫瘤的診斷治療開辟一條新途徑。

5 展望 Livin作為 IAPs家族的新成員,具有特異的BIR和 RN G指結(jié)構(gòu)域,可以通過多種途徑發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡作用。Livin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和耐藥密切相關(guān),并為腫瘤的早期診斷、基因治療和細(xì)胞治療提供了新的靶點(diǎn)。

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