布魯氏菌疫苗的研究進(jìn)展

王羽

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

布魯氏菌病的預(yù)防主要通過接種疫苗實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有的畜用減毒活疫苗有S19、S2、M5和RB51等，死疫苗有牛種布魯氏菌45/20,羊種布魯氏菌H38等，人用活疫苗主要有19-B和104M等?，F(xiàn)有的疫苗種類有死疫苗、減毒活疫苗等，但是應(yīng)用效果比較好的還是減毒活疫苗，其它種類的疫苗雖也有人嘗試，但效果均不好。我國目前使用比較廣泛的減毒活疫苗株有羊種布魯氏菌減毒疫苗株M5，豬種布魯氏菌減毒疫苗株S2，以及牛用布魯氏菌疫苗S19等，其中M5疫苗株是由我國馴化出來的一株弱毒株，在我國的應(yīng)用廣泛，使用效果很好。在這些疫苗株的使用中還發(fā)現(xiàn)，它們具有交叉免疫保護(hù)效果?，F(xiàn)有減毒活疫苗的廣泛使用，對于預(yù)防布魯氏菌病的發(fā)生、防止疫情進(jìn)一步蔓延以及疫源地?cái)U(kuò)大等方面起到了關(guān)鍵性的作用。我國曾一度將布魯氏菌病控制得很好，就是得益于大范圍的使用疫苗預(yù)防。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，核酸疫苗、蛋白重組疫苗、基因缺失疫苗等基因工程苗成為了科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。2002年后，伴隨布魯氏菌基因測序的完成，布魯氏菌疫苗進(jìn)入了反疫苗學(xué)時(shí)代。本文就布魯氏菌的各種疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

一、布魯氏菌疫苗研究策略的演化

布魯氏菌病嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，研究者對其疫苗的研究已經(jīng)很多年。其研發(fā)策略經(jīng)歷了逐漸改進(jìn)和完善的過程，根據(jù)不同時(shí)期研究策略側(cè)重點(diǎn)不同，可以將其大致分為三個(gè)階段。

第一階段：傳統(tǒng)疫苗(活苗，死苗)：在布魯氏菌防治方面發(fā)揮了重要的作用。其中牛用S19，豬用S2，羊用M5，仍然是防治布魯氏菌病的重要疫苗。在傳統(tǒng)疫苗中，活苗的免疫效果雖然很好，但是對接種的動(dòng)物造成一定的影響，對人也會(huì)引起感染，且易發(fā)生返祖現(xiàn)象。死苗雖然不會(huì)出現(xiàn)上述現(xiàn)象，但其免疫效果不好，用量大，遺傳穩(wěn)定性差。

第二階段：20世紀(jì)70年代以來，迅速發(fā)展的重組DNA技術(shù)為疫苗的研究提供了新的手段。布魯氏菌基因工程疫苗也開始發(fā)展。核酸疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗等成為科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)?；蚬こ桃呙缈朔藗鹘y(tǒng)疫苗的易返祖，影響接種動(dòng)物等不足，且其安全問題比較容易控制和處理，因此，基因工程疫苗將在防治布魯氏病中做出重大的貢獻(xiàn)。

第三階段：2000年6月26日，人類基因組測序完成標(biāo)志著人類進(jìn)入了后基因組時(shí)代。疫苗的研究也開始改變過去從表型分析入手的思維方式，而是從全基因水平來篩選具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的候選抗原。這種以基因組為基礎(chǔ)的疫苗發(fā)展策略，稱為反疫苗學(xué)。2002年以來，羊種、牛種、豬種布魯氏菌基因組測序相繼完成，為反疫苗學(xué)研發(fā)打下了基礎(chǔ)。布魯氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究將成為當(dāng)今疫苗研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

二、布魯氏菌疫苗研究現(xiàn)狀

(一)布魯氏菌重組菌疫苗 重組菌疫苗是通過了解布魯氏菌的基因序列后，滅活其某段基因片段而得到的菌株。目前的研究集中在perosamine合成酶的編碼基因的滅活和冷休克蛋白的編碼基因滅活后得到的菌株。重組菌得到的疫苗，其毒力比原始疫苗的毒力小，無需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物，吳清民用羊種布魯氏菌的重組菌免疫小鼠，得到其免疫保護(hù)效力與現(xiàn)有疫苗株相當(dāng)。通過PCR方法可以鑒定出患病動(dòng)物體內(nèi)分離的菌株是疫苗菌株還是野生菌株。但是重組菌疫苗必須有配套的鑒別診斷試劑。該種疫苗還沒有進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，是否有返祖現(xiàn)象還不是很清楚，需要進(jìn)一步的研究。

(二)布魯氏菌亞單位疫苗 已知布魯氏菌基因編碼的各種蛋白質(zhì)產(chǎn)物中Omp,L7/L12等具有抗原性，因而可用基因工程技術(shù)，取出布魯氏菌中編碼相應(yīng)抗原肽段的基因，再將此基因與質(zhì)粒等載體重組，導(dǎo)入受體菌或細(xì)胞，使之在受體菌或細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量保護(hù)性肽段，提取此保護(hù)性肽段，加佐劑后即成為基因工程亞單位疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙缗c傳統(tǒng)疫苗相比，抗原成分單一，可以用血清學(xué)方法有效的鑒別，其抗原為蛋白質(zhì)，與其他新型疫苗相比不會(huì)發(fā)生可能出現(xiàn)的基因重組問題，較安全。但是該疫苗為死苗，在體內(nèi)不能復(fù)制，免疫原性不及常規(guī)疫苗，而且生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，故直至目前仍未能普遍推廣。

(三)布魯氏菌基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)使微生物基因組中控制毒力的基因缺失而制成的疫苗。目前基因缺失疫苗也是布魯氏菌疫苗的熱門研究。據(jù)報(bào)道，有人用S19作為起始材料，利用基因工程技術(shù)去除Bp26和Bmp18得到的弱毒疫苗株△S19-2。該弱毒疫苗接種動(dòng)物后能與其它菌株感染動(dòng)物用有效的方法區(qū)分開來。并且其毒力明顯比S19株弱。也有人去除WboA基因的方法構(gòu)建基因缺失疫苗。該種疫苗具有良好的安全性和免疫保護(hù)性，并且免疫動(dòng)物后具有不干擾臨床診斷的特點(diǎn)。是布魯氏菌疫苗研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)。

(四)DNA疫苗 由于布魯氏菌是胞內(nèi)菌，機(jī)體的細(xì)胞免疫是控制布魯氏菌感染的關(guān)鍵，因此作為研究布魯氏菌DNA疫苗的候選分子主要集中在刺激T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫的幾個(gè)分子。目前布魯氏菌DNA疫苗包括P39，L7/L12，GroEL和Omp31等四種。此外，DNA疫苗具有制備方便，對宿主安全，儲藏方便，成本低等特點(diǎn)。目前DNA疫苗研究已經(jīng)取得了一些有意義的成果，但是至今還沒發(fā)現(xiàn)一種DNA疫苗可以完全代替滅活苗和減毒苗。

(五)治療性疫苗 目前，常用的疫苗如S19是通過非腸道途徑接種的，可以有效的保護(hù)機(jī)體避免再次受到布魯氏流產(chǎn)菌S19的感染。但接種該活菌易產(chǎn)生類似自然感染的癥狀，診斷困難。并且活菌疫苗有返祖的危險(xiǎn)。Pasquali等發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌2308的突變株缺乏脂多糖O抗原，但仍然保留毒力，因此通過將該突變株的致病性減弱，構(gòu)建出RB51疫苗，它在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生針對脂多糖O抗原的抗體，因此不會(huì)給機(jī)體造成損害。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明流產(chǎn)布魯氏菌RB51疫苗經(jīng)口腔途徑免疫后，能夠清除體內(nèi)經(jīng)不同途徑感染的細(xì)菌，并產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體不被流產(chǎn)氏菌有毒菌株2308再感染。但是不產(chǎn)生抵抗布魯氏菌的抗體。當(dāng)前的治療性疫苗的效果還不十分穩(wěn)定和理想，因此需要不斷進(jìn)行治療劑量和免疫次數(shù)的優(yōu)化，改善疫苗組成成分，使治療性疫苗能推廣應(yīng)用。

(六)聯(lián)合疫苗 聯(lián)合疫苗可以減少免疫劑量，簡化免疫程序，是目前疫苗研究的一個(gè)發(fā)展趨勢。關(guān)于布魯氏菌的聯(lián)合疫苗已經(jīng)進(jìn)入了實(shí)驗(yàn)階段。研究表明：不同細(xì)菌的多種抗原和佐劑制成的多價(jià)疫苗，不僅可以一次預(yù)防多種疾病，并且免疫后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫原性和免疫保護(hù)力都有提高，且各組成成分具有協(xié)同作用。在聯(lián)合疫苗中加入包裹劑和佐劑，增強(qiáng)了抗原遞呈細(xì)胞對目的抗原的攝取、加工和處理，提高了APC細(xì)胞對抗原肽的遞呈能力。而且，包裹包還減少了核酸酶降解抗原基因，并通過緩釋作用而延長了抗原表達(dá)期。

聯(lián)合疫苗的研究是當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)，國內(nèi)外很多研究者都在對此進(jìn)行研究。如余大海等關(guān)于結(jié)核桿菌和布魯氏菌多價(jià)DNA疫苗的研究。試驗(yàn)證明：采用治療型多價(jià)DNA疫苗和傳統(tǒng)藥物相結(jié)合治療，使藥物引起的免疫反應(yīng)，在DNA疫苗的作用下，得到加強(qiáng)并迅速向有利于殺傷感染結(jié)核桿菌細(xì)胞的TH1型反應(yīng)進(jìn)行，治療時(shí)間縮短到原來的一半，減少了抗藥性和耐藥性的產(chǎn)生，提高了治療效率。

(七)分子標(biāo)記疫苗 動(dòng)物接種疫苗后，由于人工免疫和自然感染動(dòng)物所表現(xiàn)的臨床癥狀相似，很難鑒別是人工免疫還是自然感染，給動(dòng)物的檢疫、運(yùn)輸、宰殺帶來了困難。而分子標(biāo)記疫苗解決了這樣的問題。

目前的分子標(biāo)記疫苗實(shí)驗(yàn)室研究大致有以下方法：(1)改造布魯氏菌本身的某種蛋白，接種動(dòng)物后，動(dòng)物將不能對該蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而判定動(dòng)物是否為自然菌株感染。如布魯氏菌P39胞質(zhì)結(jié)合蛋白是一種很好的的T細(xì)胞抗原，能誘發(fā)強(qiáng)烈的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，并產(chǎn)生大量的INF-γ，純化的重組P39對于動(dòng)物布病的血清學(xué)診斷是一個(gè)優(yōu)良的抗原。將P39蛋白改造后的菌株接種動(dòng)物，該動(dòng)物將不能對P39產(chǎn)生免疫反應(yīng)，用它制備抗原避免了混淆人工免疫還是自然感染。(2)帶有免疫標(biāo)記的重組菌疫苗，該疫苗免疫動(dòng)物后產(chǎn)生了與當(dāng)前疫苗及自然感染不同的免疫反應(yīng)狀態(tài)，通過動(dòng)物血清的免疫學(xué)檢測能夠?qū)⒒疾?dòng)物從免疫動(dòng)物群體中鑒別出來。(3)在減毒活疫苗株的基礎(chǔ)上,對菌株進(jìn)行改造,敲除布魯氏菌的重要診斷抗原基因,使疫苗株的毒力進(jìn)一步降低,然后根據(jù)兩者序列的差異,建立鑒別PCR的方法,以區(qū)分人工免疫和自然感染。

三、展望

布魯氏菌病屬于人畜共患病，近年來又有上升的趨勢，嚴(yán)重影響著我國的畜牧業(yè)發(fā)展。DNA疫苗以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為目前研究的熱點(diǎn)。但在臨床試驗(yàn)中效果并不如意，所以在未來的研究中應(yīng)該對DNA疫苗進(jìn)行改造，包括其載體、接種方式(基因槍技術(shù)，電穿孔技術(shù))及佐劑的改造，可以成為布魯氏菌基因工程苗的下一個(gè)研究方向。

布魯氏菌病在全球再次肆虐，其中的一個(gè)原因就是沒有有效的人用的布魯氏菌疫苗來阻斷患病動(dòng)物向人類的傳播。伴隨布魯氏菌基因組工作的相繼完成，利用功能基因組和功能蛋白組，可以篩選出具有免疫蛋白原性的蛋白質(zhì)和確定疫苗的候選，使我們有希望達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，這同樣也是布魯氏菌疫苗研究的一個(gè)方向。

另外，結(jié)合動(dòng)物防疫的需要和減少因疫苗注射而引起的應(yīng)激反應(yīng)，利用口服植物來表達(dá)布魯氏菌疫苗也是一種較好的選擇。

略)