動物活體光學成像的應用進展

余松濤,黎 川,陳 陵,湯旭東,房殿春,楊仕明

(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍消化病研究所,重慶,400038)

隨著對亞細胞結構和功能、分子生理和病理、細胞間和細胞內信號通路研究的深入,人類對疾病和對生命本質的認識不斷被追朔到蛋白質、基因水平。在上個世紀發(fā)展起來的CT、MRI、PFT、超聲等宏觀影像技術已經(jīng)遠不能滿足對活體環(huán)境內細微生命過程的探詢。組織切片和免疫染色能夠部分解釋一些生物現(xiàn)象,但是需要研究對象與活體組織的分離,所得結果與其在活體內機制難免有所偏離,甚至完全相反。熒光染料(fluorescent dye)能對多種細胞共價標記并進行活體顯像,但多被限制于體外培養(yǎng)的細胞。其化學毒性和對活體內環(huán)境的化學干擾使其在活體應用受到極大限制。熒光蛋白和螢光素酶作為具有生物活性的蛋白質,在活體內無毒、無放射損傷、可代謝、可穿過各種膜屏障。它們的編碼基因片段小,可以被融合標記于絕大多數(shù)蛋白質和細胞,甚至可以對整個生物體進行全身背景標記。在不影響生物體任何結構和功能的前提下,這些熒光基團配合外部檢測設備可以對各種體內生物現(xiàn)象進行實時活體顯像。

1 熒光與生物發(fā)光

目前醫(yī)學研究應用得最多的熒光基團實際上包括激發(fā)熒光蛋白所得到的熒光和體內化學反應所得的生物發(fā)光兩類:天然熒光蛋白經(jīng)一定波長的激發(fā)光照射后發(fā)出的光叫熒光(Fluorescence);螢光素酶催化相應底物發(fā)生化學反應產生的螢光叫生物發(fā)光(bioluminescence),實質上是一種化學發(fā)光。

1.1 熒光蛋白及其應用

熒光是指某些特殊物質如熒光蛋白經(jīng)特定波長的激發(fā)光(入射光,通常是短波高能的紫外線)照射,吸收光能后由基態(tài)進入激發(fā)態(tài)、并立即返回基態(tài),同時發(fā)出比入射光波長更長的發(fā)射光(出射光,通常是長波低能的紅外或可見光)。這種發(fā)光具有瞬時性。激發(fā)光一旦停止照射出射光隨即停止。自然界的熒光蛋白有很多種。最初被人類發(fā)現(xiàn)的是綠色熒光蛋白(GFP),由Chalfic等1994年從維多利亞水母(Aequorea Victoria)發(fā)光現(xiàn)象中分離純化出的基因[1-2]。近年來一些新發(fā)現(xiàn)的具有長波長發(fā)射譜的天然熒光蛋白或人工突變體被廣泛應用于生物醫(yī)學研究[3-5]。

美國抗癌研究所Hoffman等[6]長期以來利用熒光蛋白進行各種活體成像的探索。他們構建了多種全身表達熒光蛋白的轉基因動物,將待研究腫瘤細胞標記上的其他顏色的熒光蛋白植入體內不同部位,在宏觀范圍活體觀察腫瘤的增殖,侵襲,轉移,極其與血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的相互作用[7]。在微觀活體單個細胞水平觀察亞細胞生物事件時,有學者在體表半分離一帶蒂皮瓣(reversible skin-flap widow),使其既有血供,又能被拉伸成為半透明組織,供高敏CCD探頭觀察其內被標記的細胞結構[8-11]。

近年來,在同一活體生物利用兩種顏色的熒光蛋白標記不同組織或同一細胞內不同結構,研究各種細胞-細胞、細胞-血管、激素-受體等相互作用生物過程,已經(jīng)得到成熟應用[12-14]。hoffman等[15]用GFP和RFP分別標記不同亞系的人纖維肉瘤細胞HT1080,靜脈注射后觀察其在肺的轉移灶熒光。通過對純紅和純綠的光團計數(shù),得到不同亞系的轉移能力和腫瘤細胞之間相互作用的影像學資料。在另一實驗中,他們將全身表達GFP的小鼠體內植入表達 RFP的腫瘤細胞[15],在4～8周的時間跨度內觀察了腫瘤與宿主血管、淋巴細胞、纖維細胞、巨噬細胞、DC細胞的相互作用。同樣的,凝血因子[16]、免疫細胞[17]等也可以用熒光蛋白標記,對其在其內的生物學行為和調控反應進行成像。

1.2 生物發(fā)光和螢光素酶[18]

1.2.1 螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng):生物發(fā)光過程本質是一種化學反應。生物體內的螢光素酶催化相應的底物發(fā)生化學反應發(fā)出的波長介于500～700 nm之間的生物光(bioluminescence),也被稱為熒光。自然界有無數(shù)種類似的螢光素酶-底物熒光發(fā)生系統(tǒng)。最受生物醫(yī)學領域關注的是細菌發(fā)光和海洋生物發(fā)光。這些生物體內都含有Lux發(fā)光基因操縱子,同時表達螢光素酶及其底物,不需要外源底物即可發(fā)光。應用于實驗動物的生物發(fā)光系統(tǒng)有北美螢火蟲螢光素酶[19](North America firefly luciferase,Fluc)和海腎螢光素酶(renilla luciferase,Rluc)及其底物。螢光素酶產生的生物發(fā)光主要特點是不需激發(fā)光而需要底物和氧氣。其波長比熒光蛋白發(fā)出的熒光長,穿透組織能力相應更強。由于不需要激發(fā)光,能夠避免由激發(fā)光產生的動物皮毛,組織和糞便的自發(fā)熒光干擾。Fluc和Rluc的底物分別是熒光素(D-luciferin)和腔腸素(coelentarizine)。前者的熒光波長540～600 nm,組織吸收和散射較少[20],而后者熒光波長460～540 nm,組織吸收多且體內代謝快[21]。因此很多活體實驗采用Fluc作為報告基因,而Rluc作為熒光強度的標準參照。不僅如此,兩種底物對胞膜通透性也不一樣,Fluc的水溶性和脂溶性都非常好,易穿透細胞膜或血腦、胎盤屏障[22～23];而Rluc在胞漿內被一種廣譜耐藥糖蛋白MDR1識別并轉運至胞外,因此很難達到細胞漿內[24]。

1.2.2 生物發(fā)光在病原體研究和感染性疾病中的應用:生物發(fā)光技術可以用來研究大分子、細胞、細菌、病毒在機體內的生物學行為。1995年,Contag等[25]首次采用螢光素酶標記沙門氏菌,評價了不同亞系菌株在小鼠體內的毒力。此后幾十種細菌被螢光素酶標記,以研究感染疾病的發(fā)病機理和治療反應。目前標記細菌主要采用兩種策略,一種是直接將Lux操縱子插入細菌染色體中,但這種方法不能運用于高等生物。另一種方法將螢光素酶編碼基因插入病原菌染色體,然后宿主動物全身給予底物,此法應用最為廣泛。發(fā)光菌Lux基因操縱子和海腎螢光素酶產生的熒光波長都在500 nm左右。而螢火蟲螢光素酶產生的熒光波長在600 nm左右。使用合適的波長濾光器即可區(qū)分這兩種波長熒光,從而達到同時對多種報告基因定位和定量。Hutchens等[26]嘗試了兩種螢光素酶同時顯像。他們在全身表達Fluc的轉基因小鼠體內注入帶有Lux操縱子的肺炎鏈球菌,觀察了細菌在或體內的致病和治療反應。螢光素酶還可以和綠色熒光蛋白或PET報告蛋白結合顯像。Yaghoubi等[27]用螢光素酶和熒光蛋白、PFT報告蛋白共標記Ⅱ型膠原特異性T細胞,并觀察了這種關節(jié)炎與膠原的關聯(lián)特征。以IRES連接后融合表達的雙報告基因一般都有 IRES下游報告基因表達衰減傾向。Wang[28]等人用十個串聯(lián)的同源結構域蛋白修飾IRES(SIRES),并用此SIRES鏈接螢光素酶和PET報告基因,發(fā)現(xiàn)SIRES下游PET報告基因的表達大大增強。Venisnik等[29]還將螢光素酶融合到抗癌胚抗原(CEA)抗體上在活體內針對CEA陽性腫瘤達到非常精細的成像。

1.2.3 生物發(fā)光在腫瘤研究中的應用:生物發(fā)光在腫瘤研究中最直接的應用是將螢光素酶基因體外標記腫瘤細胞,再經(jīng)皮下成瘤、或原位移植瘤,觀察原發(fā)腫瘤的血管侵襲、遷移等一系列生物特征。螢光素酶也可以和熒光蛋白聯(lián)合應用,分別標記不同細胞在同一活體內顯像,或標記同種細胞不同亞細胞結構。根據(jù)發(fā)光是否與底物導入有關將兩種報告基因區(qū)分開。Edinger等[30]將螢光素酶和熒光蛋白同時標記的淋巴瘤細胞植入小鼠后觀察了其在體內的定殖,擴張,轉移,以及其對放療,化療和免疫治療的反應。他們還將NK-T細胞標記并觀察了其進入并殺傷腫瘤組織的全過程。Catherine等[31]將GFP和螢光素酶同時標記的小鼠肝癌模型,并對myc癌基因進行失活,觀察到失活myc后肝癌細胞向正常干細胞分化并開始表達正常干細胞的標志物。再激活myc后細胞又轉向癌細胞分化。Stathopoulos等[32]用綠色熒光蛋白和螢光素酶雙報告基因標記的lewis肺癌細胞靜脈注射小鼠,發(fā)現(xiàn)體外檢測到的肺部熒光強度和肺表面癌胞數(shù)成正相關。他們還將這種lewis肺癌細胞直接注射到小鼠胸膜內,活體觀察了小鼠的胸腔積液特點。

螢光素酶的缺點主要表現(xiàn)在底物的導入對設備和技術的要求。其次是螢光素酶催化底物發(fā)生的反應是需氧反應,因此在缺氧組織的報告基因多有失真現(xiàn)象。Cecic等曾就此將螢光素酶與lacZ報告系統(tǒng)在缺氧腫瘤組織中做過對比[33],發(fā)現(xiàn)缺氧組織中螢光素酶報告存在失真現(xiàn)象。

2 幾種相關技術

2.1 CCD相機與小動物整體成像

目前使用的活體小動物整體成像設備多使用背部薄化、背照射的冷CCD照相機(charge coupled device cameras)[34]。CCD技術上分為前照射和背照射。前照射型在光信號和CCD芯片之間有一層多硅層和二氧化硅層,減少了CCD的量子效率,光信號衰減而小于理論值。而背部薄化、背照射的冷CCD照相機(back-thinned and backilluminated)將多硅層和二氧化硅層去掉,能夠檢查到深層活體組織發(fā)出的極為微弱的熒光。但同時提高了成本,也失去了多硅層和二氧化硅層對于芯片的保護作用。因此一般體外細胞實驗都使用前照射CCD,只有在整體動物成像或對極微弱熒光成像時才采用背照射。

小動物整體熒光成像時,動物被麻醉后放置在絕對密閉暗箱內的可調平臺上。在普通光照下拍攝一次背景照片,再用CCD拍攝熒光圖像。軟件疊加后得到整體小動物體內的熒光圖像。如果對于某些部位的熒光有較高的分辨率和精細度要求,則打開一個外科的體表皮瓣窗(skin-flap window)以減小熒光從組織到達探頭的距離,提高檢出的熒光強度。針對熒光蛋白的小動物整體成像責需要激發(fā)光發(fā)生器及濾波器,發(fā)射光濾波器和CCD探頭組成。對于不同的熒光蛋白,不同波長的激發(fā)光經(jīng)過濾波器照射到動物活體組織,激發(fā)的發(fā)射光又經(jīng)可調波長的發(fā)射濾波器后到達探頭。激發(fā)光裝置一再簡化,目前甚至最簡單的LED閃光燈都可以用于熒光蛋白的整體成像[35]。最近應用的光譜顯像(spectral imaging)是一種能夠將自發(fā)熒光和標記熒光分辨開來的顯像模式。在常規(guī)光學鏡頭前加一個低溫單色攝像頭和液晶可調濾光器。然后從500到650nm發(fā)射光波譜每10 nm取一張圖,按順序排列為光譜序列圖,用軟件將這些光譜序列圖和RFP或GFP自發(fā)熒光光譜進行對照分析后可以得到光譜圖像[7]。這種光譜顯像最為顯著的優(yōu)點是大大減小了皮毛和組織自發(fā)熒光的干擾。目前常用的整體/顯微多用途熒光成像系統(tǒng)有OV100(Olympus Optical,德國),eXplore Optix(NIR)系統(tǒng)(General Electrics Healthcare,加拿大),和 Xenogen IVIS系統(tǒng)(Xenogen Corporation,Hopkinton,美國),MaestroTM系統(tǒng)(Cambridge Research&Instrumentation,CRI)[36]。Alencar等[51]開發(fā)了一種針尖物鏡頭深入到組織內部。其時間,空間和波長分辨率都很好。hoffman等用這種配備針尖物鏡的激光顯微鏡對活體內細胞成像,觀察到高度清晰的腫瘤細胞和宿主細胞相互作用的顯微圖片[37]。

2.2 多光子成像技術

多光子顯微鏡是近年來應用最廣泛的活體弱熒光檢測技術。單光子激發(fā)情況下,激發(fā)光多需要紫外光。雙光子激發(fā)時采用兩個紅外光子同時激發(fā)熒光基團。這種長波的激發(fā)光能夠很好的穿透組織且損傷極小,提高了活體顯像的體層深度,延長了活體樣本的耐受時間。此外,雙光子熒光激發(fā)只發(fā)生在焦點平面,減少了焦點外的偽影干擾。降低紫外光用量也降低了對光學元件的限制[38]。綜合起來,雙光子顯微鏡具有以下幾個優(yōu)點[39]:①具有高空間局域性和高分辨率;②雙光子激發(fā)的發(fā)射熒光波長遠離激發(fā)波長,避免了激發(fā)光對發(fā)射光的干擾,能實現(xiàn)暗場成像。同時散射產生的背景噪聲小,圖像對比度高;③焦點以外不發(fā)生光漂白現(xiàn)象;④激發(fā)光源采用紅外光,能對生物組織的深層成像。

同一種熒光基團在吸收單個光子和吸收雙光子的情況下激發(fā)情況不同。有的基團在吸收單光子時不發(fā)出熒光而在吸收雙光子時發(fā)出熒光。因此通過控制體外激發(fā)光波長可以達到對體內特定的熒光基團進行光控開關[40]。這種激發(fā)光控制分子熒光開關技術用于活體熒光顯像,可以獲得焦平面15 nm的分辨率,對亞細胞結構很好分辨率。極低的組織損傷使得很多瞬時的生物過程得以長時觀察。如腎濾過[41],膠質細胞突觸形成[42],免疫系統(tǒng)[43],鈣質代謝[44]等。

2.3 活體的斷層熒光成像與三維熒光重建

在某種均一生物組織中,體層內部熒光穿過組織細胞時都有一定的吸收。在體表探測到的熒光衰減的量,和組織厚度密度成正比。由此根據(jù)一定的算法就可以得出體表某一點熒光的實際體層深度。把各點的深度得出后就可以得到動物各個體層的熒光斷層圖像(fluorescence molecular tomography,FMT)[45-46]。這種三維熒光活體成像技術至少需要三項參數(shù):測量組織的光學特性;預測特定光源下模型動物體表的光強度分布特點;軟件重建組織深度和熒光能量。該技術最初只能在非生物的假動物模型中模擬,Zacharakis等[47]首次使用活體小鼠進行了三維活體顯像。Comsa等[48]用擴散近似值法先從普通活體熒光成像中獲得兩種圖像:一種反射圖像來得到實驗動物的組織光學特性,一種熒光發(fā)射圖像來重建組織深度和熒光能量。使用同樣方法他們在處死后小鼠體內植入的點光源進行了熒光三維重建[49]。最初的熒光活體三維重建技術都是基于理想化的密度均一組織,Virostko等[50]將點光源植入小鼠腹腔,首次研究了非均質組織的光學特性和三維熒光重建的準確率。Alexandrakis等[51]用 PET先對小鼠作高清晰的立體解剖圖,將各層光學特性用PET數(shù)據(jù)記載下來。精確計算了熒光在各層組織中的衰減率,同時可以測算特定深度所需的最低組織光學特性精確度。也可以先用多角度結構光將小鼠表面立體重建,彌散近似法計算熒光的組織衰減。這種方法對單次成像成像的表面熒光圖像重建后可以獲得高度清晰的3-D熒光圖像[52]。這種方法已經(jīng)在小鼠前列腺腫瘤細胞活體三維成像中得到應用。Garofalakis等[53]用旋轉的載物架和CCD相機得到不同旋轉位置的小鼠體內熒光圖像,軟件重建之后將小鼠脾內3×105個表達綠色熒光蛋白的T淋巴細胞團立體顯影。Montet等[54]將小鼠體內熒光標記的大腸癌腫瘤血管進行體層顯像,觀察到了各種促血管信號通路阻斷后對血管生成的影響,以及抗血管生成治療手段的療效。Huang[55]最近發(fā)表在Science上的文章報道了一種稱為STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)的3D熒光顯微系統(tǒng)[55]。這種系統(tǒng)可以達到最高平面分辨率為20～30 nm,軸向分辨率50～60 nm。基本可以對細胞內部熒光基團進行立體顯像。目前不管是宏觀的還是微觀的立體顯微鏡都不能對或體內的生物現(xiàn)象進行長時觀察。Vinegoni等[56]在Nature上報道了一種介觀(mesoscopic)顯微系統(tǒng)。能夠在介于宏觀和微觀之間(納米和毫米之間)對果蠅蛹的形態(tài)學變化進行長時間熒光斷面和立體成像,觀察其生長發(fā)育和對環(huán)境藥物等刺激的反應。

基因和蛋白質功能的研究,各種信號通路、腫瘤靶向技術和免疫機理研究都離不開生物的活體環(huán)境?；铙w熒光成像相關的一系列技術目前致力于擴大標記靶標的范圍、增加檢測的敏感性、減小報告子對活體環(huán)境的干擾、提高對活體環(huán)境的模擬水平。隨著DNA及蛋白質靶向技術,三維熒光技術、多光子技術的逐漸成熟,整體活動物內的細胞分子水平研究已經(jīng)取代了離體的、無生命的研究時代。在弱熒光檢測硬件的推動下,活體生物內部世界更多秘密將會被我們用眼睛看到。

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