昆明地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA1-17系統(tǒng)基因多態(tài)性的分析

朱祥明，楊通漢，姚富柱，湯 戎，趙 楊，蘇品璨，羅 臻，涂源泉，郭 萍，姚 杰，李開(kāi)紅

（昆明血液中心，云南 昆明 650106）

人類血小板同種抗原（human platelet alloantigen,HPA）是分布在血小板糖蛋白上一類特異性抗原，又稱血小板特異性抗原。由于HPA的不配合而產(chǎn)生的血小板抗體可以導(dǎo)致新生兒同種免疫血小板減少癥（NAITP）、輸血后紫癜（PTP）以及致血小板輸注無(wú)效（Platelet Transfusion Refractoriness,PTR），給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這是臨床和輸血領(lǐng)域共同遇到的重要問(wèn)題[1-5]。

研究不同地區(qū)人群的HPA頻率，建立已知型地區(qū)性血小板獻(xiàn)血者資料庫(kù)，可大力解決因血小板同種免疫造成的血小板輸注無(wú)效及輸血后紫癜的難題，具有重要的臨床指導(dǎo)意義[6]。

作者對(duì)1000名無(wú)血緣關(guān)系的自愿無(wú)償單采血小板獻(xiàn)血者做HPA-1-17等位基因進(jìn)行分析。獲取了昆明地區(qū)人群HPA-1-17基因頻率，建立了的已知型血小板獻(xiàn)血者基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為解決昆明地區(qū)血小板同種免疫輸注難題及血小板同種免疫疾病診斷奠定了基礎(chǔ)[7-9]。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象 1000名昆明地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系固定無(wú)償單采血小板捐獻(xiàn)者，漢族，年齡18～50歲，每名志愿者采集外周靜脈血5ml。

二、試劑及儀器 5%EDTA-Na2，ST系列一次性真空采血管（北京批號(hào)：071020）；TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技，批號(hào)：H6820）；TaqDNA聚合酶（Roche公司，批號(hào)：06077E）；血小板同種抗原1-17基因分型檢測(cè)試劑盒（天津，批號(hào)：1001A）所用試劑均在有效期內(nèi)，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)使用。超微量核酸測(cè)定儀 （Thermo Biomate3），9700PCR擴(kuò)增儀（ABI公司），電泳儀（AB gene公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。DNA制備嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)提取DNA，并采用核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，并調(diào)定至 （50～150） ng/μl，純度A260/280=1.6-1.9。

三、基因分型（HPA1-17分型） 1.PCR擴(kuò)增體系及條件 擴(kuò)增體系每人份用量中包括：140μl濃縮dNTP-Buffer+180μl去離子水+3.3μl-Taq 酶(5U/μl)+50μl樣品DNA 共373.3.7μl混合液，分別向34個(gè)引物孔各加入上述混合液。擴(kuò)增條件為：96℃，2min；96℃ 20s，70℃ 60s，8個(gè)循環(huán)；96℃ 20s，64℃ 50s，72℃ 45s，10個(gè)循環(huán)； 96℃20s，61℃ 50s，72℃45s擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。最后4℃保存。

2.凝膠電泳 PCR產(chǎn)物分析采用TBE緩沖液制備的3%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色,150V電泳10分鐘后紫外燈下拍照記錄。

3.結(jié)果判斷 在紫外透射下，出現(xiàn)內(nèi)照帶表示PCR擴(kuò)增成功，有特異擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的反應(yīng)為陽(yáng)性。對(duì)照反應(yīng)格局圖，判定HPA1-17基因型。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 HPA基因命名參照[10]。HPA采用方根法由表型頻率估計(jì)基因頻率[11]：抗原頻率（f）i=陽(yáng)性抗原數(shù)/N，基因頻率(gf)=1－（fi為表型頻率，N為觀察數(shù)，gf為基因頻率）。HPA不配合率=(1-P)2×P(F為表型頻率)?；蛐陀^察值與期望值之間的吻合度采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

結(jié) 果

經(jīng)PCR-SSP檢測(cè)，1000名血小板獻(xiàn)血者均得到HPA1-17抗原34個(gè)等位基因電泳結(jié)果，詳見(jiàn)表1-2，隨機(jī)選3個(gè)樣本，舉例如圖所示（見(jiàn)圖1、2、3）。

樣本1的基因型為：1a/1a，2a/2a，3a/3a，4a/4a，5a/5a，6a/6b，7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

樣本2的基因型為：1a/1a,2a/2a,3a/3b,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

樣本3的基因型為：1a/1a,2a/2a,3a/3a,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15b,16a/16a,17a/17b

本次研究中，昆明地區(qū)漢族人群血小板獻(xiàn)血者HPA1-17基因和基因頻率見(jiàn)表4，每個(gè)樣本均檢測(cè) 到 HPA-1a， 2a， 4a-14a， 16a， 17a 基 因 ；HPA-4a，7a-14a，16a，17a呈現(xiàn)單態(tài)性，未檢測(cè)出相應(yīng)的等位基因HPA-b;對(duì)于HPA-1、-2、-5、-6主要以a/a純合子為多，a/a基因型頻率分別是0.989、0.96、0.99、0.98，沒(méi)有b/b純合子出現(xiàn)。在HPA1-17中，具有最高雜合度的是HPA-15，基因型HPA15a/15a，HPA15a/15b，HPA15b/15b 頻率分別是0.392、0.36、0.248；HPA-3在其次，基因型HPA3a/3a，HPA3a/3b，HPA3b/3b頻率分別是0.339、 0.467、 0.194。 經(jīng) χ2檢 驗(yàn) ， 結(jié) 果 符 合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（見(jiàn)表1）。

本次研究為國(guó)內(nèi)外類似報(bào)道中，首次完整地檢測(cè)了血小板獻(xiàn)血者HPA1-17基因遺傳多態(tài)性，與國(guó)內(nèi)外的一些HPA群體遺傳學(xué)部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

討 論

血小板抗原具有高度多態(tài)性，它的多態(tài)性是由位于血小板糖蛋白上的單個(gè)堿基取代而導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變而產(chǎn)生的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和對(duì)人類血小板抗原基因結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，使得血小板抗原的檢測(cè)方法由傳統(tǒng)的血清學(xué)方法發(fā)展為以DNA為基礎(chǔ)的HPA基因分型方法。本文采用PCR-SSP對(duì)昆明地區(qū)1000名自愿單采血小板獻(xiàn)血者進(jìn)行HPA1-17系統(tǒng)進(jìn)行了基因分型，結(jié)果提示了昆明地區(qū)獻(xiàn)血者HPA1-17基因型和等位基因頻率分布概況，為建立已知型血小板獻(xiàn)血者庫(kù)和血小板配合性輸注提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

HPA抗體雖不是引起血小板輸注無(wú)效的最主要免疫因素[21]，但是患者一旦產(chǎn)生抗HPA抗體，其所導(dǎo)致的血小板輸注無(wú)效將非常嚴(yán)重[22]。本次研究的HPA結(jié)果與國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)及國(guó)家相比，基因頻率不盡相同（表2），其中HPA-3a系統(tǒng)與我國(guó)其他城市、亞洲國(guó)家和地區(qū)（日本、臺(tái)灣、泰國(guó)）相似，而與英國(guó)、美國(guó)人種有較大差異。HPA-15a系統(tǒng)頻率與重慶、廣州報(bào)道相似；而與青島、臺(tái)灣、英國(guó)、美國(guó)等地的報(bào)道有較大差異。本次調(diào)查結(jié)果再次證實(shí)HPA-3、15在中國(guó)漢族人群中具有較高遺傳多態(tài)性，在臨床輸血實(shí)踐中是最為重要血小板抗原系統(tǒng)。對(duì)HPA抗原作基因分型，在血小板同種免疫引起的NAITP，PTP以及PTR的診斷中，具有重要的臨床意義[23]。

本次研究表明昆明地區(qū)漢族血小板獻(xiàn)血者HPA1-17基因頻率與南方漢族接近，也呈現(xiàn)其自身的特點(diǎn)。隨著輸血技術(shù)的發(fā)展和成分輸血的普及，血小板減少癥患者接受單采血小板輸注，可減少出血的危險(xiǎn)，有效提升血小板計(jì)數(shù)，單采血小板的輸注也逐漸被廣泛應(yīng)用于臨床。由于血小板輸注的局限性，目前臨床上輸注單采血小板時(shí)，仍采用隨機(jī)化的方法（即ABO血型相合性輸注，未經(jīng)血小板血型交叉配合相合） 輸注，因而可能被血小板同種抗原免疫致敏，主要產(chǎn)生抗HLA-Ⅰ和抗HPA。選擇HLA配合的血小板，或HLA及HPA都配合的血小板，是減少免疫性血小板輸注無(wú)效的較為理想的方法[24,25]。通過(guò)對(duì)某地區(qū)人群HPA的篩查，可掌握該區(qū)域人群中HPA基因型分布情況，為臨床上需要輸注血液或成分血的患者提供相匹配的血液制品，提高血小板輸注的安全性和有效性。本次調(diào)查的1000名的單采血小板獻(xiàn)血者HPA基因頻率,，經(jīng)分析符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明結(jié)果是可信的。據(jù)此建立的血小板獻(xiàn)血者基因庫(kù)，不僅可為昆明地區(qū)人群制定血小板同種免疫性疾病的篩選計(jì)劃提供根據(jù)，而且可為探索民族起源、遺傳、遷徙及法醫(yī)個(gè)體識(shí)別提供科學(xué)數(shù)據(jù)[26]。

表1 昆明地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA1-17基因型和基因頻率分布

表2 昆明地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA1-17基因分布特點(diǎn)與其它種族、地域間的群體比較

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