毛細(xì)管電泳吡啶釕電化學(xué)發(fā)光檢測天仙子中生物堿

1 引 言

天仙子是一種天然中草藥，它的主要活性成分為阿托品和東莨菪堿 。目前，分析天仙子的方法主要有：核磁共振技術(shù)、紫外分光光度法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳分離法等。毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）具有進(jìn)樣體積小、分離效率高等優(yōu)勢。吡啶釕（Ru(bpy)2+3）電化學(xué)發(fā)光法具有激發(fā)態(tài)壽命長、發(fā)光效率高、試劑可循環(huán)再生等優(yōu)點。 CE與Ru(bpy)2+3電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)（CE-ECL）將二者優(yōu)勢有機(jī)組合，已成為分析化學(xué)領(lǐng)域中很好的分析工具。阿托品和東莨菪堿具有叔氨結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光，本研究采用CE-ECL分析技術(shù)分析了中藥天仙子中的阿托品和東莨菪堿。



2 實驗部分

2.1 儀器與試劑 毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光綜合分析儀（西安瑞邁電子科技有限公司）。ECL檢測采用三電極系統(tǒng)：直徑500 μm Pt盤工作電極、Ag/AgCl飽和參比電極、Pt絲對極。石英毛細(xì)管（52 cm×25 μm i.d.，河北永年光學(xué)纖維廠）。三聯(lián)吡啶釕六水合氯化物(美國Aldrich公司）。硫酸阿托品和氫溴酸東莨菪堿（美國Sigma公司）。磷酸鹽、NaOH、氯仿和石油醚均為分析純。二次蒸餾水采用Mili-Q超高純凈水體系（美國Milipore公司）制備，所有溶液均用二次蒸餾水配制。中藥天仙子購于長春市藥材公司。

2.2 實驗方法 毛細(xì)管用0.1 mol/L NaOH充滿并浸泡過夜。電泳分離之前，分別用0.1 mol/L NaOH、二次蒸餾水、緩沖液沖洗毛細(xì)管各10 min。ECL檢測池中添加5 mmol/L 三聯(lián)吡啶釕、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.48），檢測池中溶液3 h后更換一次，以保持實驗重現(xiàn)性。本實驗采用柱端ECL檢測模式，借助光學(xué)顯微鏡準(zhǔn)直工作電極與毛細(xì)管出口端，并固定二者距離為150 μm。綜合考慮進(jìn)樣量對檢測靈敏度和分離度雙重影響，本實驗電動進(jìn)樣條件為12 kV×9 s。分離緩沖溶液pH 8.48，檢測電位1.2 V，光電倍增管偏置電壓800 V。

2.3 中藥生物堿的提取 取約0.5 g碾成粉末狀的天仙子準(zhǔn)確稱重，加入5 mL石油醚超聲20 min，棄掉石油醚層。加入4 mL氯仿超聲20 min，萃取過程重復(fù)2次。提取液合并后揮干，提取物用二次蒸餾水溶解，經(jīng)0.45 μm醋酸纖維膜過濾，濾液儲存于4 ℃冰箱中備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 分離緩沖溶液pH值的影響 當(dāng)緩沖溶液的pH值在4.06~6.08之間，兩峰重疊。隨著pH值增加，東莨菪堿遷移行為發(fā)生改變，兩峰部分分離，pH=8.48時分離度最高。繼續(xù)增大堿度分離度反而減小，可能是由于二者在偏堿性緩沖液中荷質(zhì)比類似具有相近的遷移行為所致。

3.２ 檢測池緩沖溶液pH值的影響 生物堿與吡啶釕發(fā)生ECL共反應(yīng)，先氧化成自由基中間體， 然后脫去質(zhì)子，與三價吡啶釕發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)Ru(bpy)2+*３，Ru(bpy)2+*３回到基態(tài)放出光子。不同胺類最佳ECL反應(yīng)所需pH值不同。隨著pH值的增大，兩種成分發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增長后下降趨勢，在pH=7.48和pH=6.03時，阿托品和東莨菪堿分別取得最高ECL強(qiáng)度。但是二者分離度隨著pH值增大而增大。本實驗緩沖溶液pH=7.48。電動進(jìn)樣12 kV×9 s。

3.3 線性范圍、精密度和檢出限 在最優(yōu)條件下， 阿托品和東莨菪堿分別在0.29～5.8 mg/L和3.0～303 mg/L范圍內(nèi)，濃度與峰高呈良好線性關(guān)系。連續(xù)進(jìn)樣6次測峰高與遷移時間的RSD，阿托品為6.1%和0.68%，東莨菪堿為5.8%和1.6%。阿托品和東莨菪堿的檢出限分為0.014和0.03 mg/L（S/N=3）。

3.4 中藥天仙子的測定 在最佳分析條件下，天仙子提取液適當(dāng)稀釋進(jìn)樣，獲得生物堿含量為：阿托品0.035%，東莨菪堿0.051%。阿托品和東莨菪堿的回收率分別為96.21%和97.04%（全文詳見http://www.analchem.cn/fujian/091157.pdf）。