慢性疼痛基因治療的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展

胡伊樂(lè),曹 靖,徐玉英,臧衛(wèi)東,涂心明

疼痛是在人體受到各種傷害性刺激時(shí)所產(chǎn)生的感覺(jué)。是存在于人體內(nèi)部的警戒與保護(hù)系統(tǒng), 對(duì)機(jī)體有重要的生物學(xué)意義, 它能引起機(jī)體產(chǎn)生被動(dòng)性防御反應(yīng)以躲避傷害刺激, 對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。但是過(guò)度的傷害性刺激不但會(huì)引起強(qiáng)烈的疼痛感覺(jué)而且還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生理功能的紊亂, 甚至休克[1-3]。痛覺(jué)種類(lèi)很多, 可以分為皮膚痛、內(nèi)臟痛和來(lái)自肌肉、肌腱和關(guān)節(jié)的深部痛。通常當(dāng)痛覺(jué)達(dá)到一定程度時(shí),可伴有機(jī)體某種生理變化以及不愉快的情緒精神反應(yīng)。 疼痛伴隨與許多疾病和創(chuàng)傷, 特別是慢性頑固性疼痛和晚期癌痛, 不僅給患者自身帶來(lái)軀體和精神上的痛苦, 同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。

1 疼痛的分類(lèi)[4,5]

慢性疼痛通常分為中樞性疼痛、組織損傷刺激、心理性疼痛、行為性疼痛4種。中樞性疼痛是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致的疼痛, 多由于傳入神經(jīng)損傷, 中樞疼痛病人常感到異常的疼痛。組織損傷刺激是慢性疼痛中最常見(jiàn)的一種, 包括癌癥、肌筋膜炎綜合癥、慢性退行性關(guān)節(jié)炎等疾病。在慢性疼痛狀態(tài)下?lián)p傷組織刺激為一重要因素。心理性疼痛較為少見(jiàn), 它一般沒(méi)有機(jī)體組織的損傷或病理改變, 完全是由于抑郁和悲觀失望或社會(huì)因素的影響, 引起心理性或者精神性疼痛, 少數(shù)患者可能有輕微的組織損傷或非組織損傷的信息,但被敏感的心理狀態(tài)予以增強(qiáng), 就表現(xiàn)出心理性疼痛。行為性疼痛更為少見(jiàn), 僅見(jiàn)于中年人群, 其疼痛形式表現(xiàn)特殊,常由行為表現(xiàn)疼痛, 因個(gè)體差異行為性疼痛表現(xiàn)亦不同,嚴(yán)重者無(wú)法從事社會(huì)活動(dòng)和工作。慢性疼痛常合并表現(xiàn)出精神抑郁、悲觀等情緒, 病人不僅有實(shí)質(zhì)性組織損傷同時(shí)還伴有嚴(yán)重的心理障礙, 因此, 在治療慢性疼痛時(shí)不能單純治療組織損傷,必須同時(shí)合并心理支持和抗抑郁治療, 只有這樣才可以有效地減輕患者疼痛感覺(jué),恢復(fù)正常功能。

2 傳統(tǒng)的疼痛治療方法[6]

目前治療疼痛的方法有多種, 針灸、按摩是傳統(tǒng)中醫(yī)治療疼痛的方法,切割與痛覺(jué)有關(guān)神經(jīng)通路的外科手術(shù)以及暗示、催眠、安慰劑等生理學(xué)方法鎮(zhèn)痛也有較好的治療效果。目前臨床應(yīng)用最多的鎮(zhèn)痛方式為藥物鎮(zhèn)痛, 常用的鎮(zhèn)痛藥物包括以下幾類(lèi)非甾體類(lèi)藥、抗抑郁類(lèi)藥、抗驚厥類(lèi)藥、阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥物。其中以阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥物效果最好, 但其長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)常導(dǎo)致過(guò)度鎮(zhèn)靜、呼吸抑制、頭暈、惡心、嘔吐、瞳孔縮小、皮膚瘙癢、便秘、尿潴留、出汗、認(rèn)知功能減退等毒、副反應(yīng)及對(duì)藥物產(chǎn)生依賴(lài)性、成癮性及耐受性等, 從而大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,尋找一種安全有效、經(jīng)濟(jì)方便、作用持久的鎮(zhèn)痛方法已成為人們感興趣的科研課題。

3 疼痛的基因治療

伴隨分子生物學(xué)技術(shù)在20世紀(jì)80 年代以后的快速發(fā)展,生命科學(xué)研究的許多領(lǐng)域都因此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用發(fā)生了質(zhì)的飛躍。分子生物學(xué)研究中,基因克隆、測(cè)序、基因表達(dá)及改變基因表達(dá)等方法日臻成熟, 為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ),也為疼痛的轉(zhuǎn)基因治療開(kāi)啟了新時(shí)代[7]。疼痛的轉(zhuǎn)基因治療包括以下幾方面內(nèi)容:①鎮(zhèn)痛基因的選擇;②鎮(zhèn)痛基因的擴(kuò)增、測(cè)序;③鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移傳遞系統(tǒng)的選擇;④鎮(zhèn)痛基因靶組織的選擇;⑤鎮(zhèn)痛目的基因表達(dá)的調(diào)控;⑥試驗(yàn)療效及安全性評(píng)價(jià)等。慢性疼痛基因治療的研究目前才剛剛起步,很多技術(shù)尚未成熟, 各種基因治療方法還處于探索階段。 慢性疼痛基因治療的研究的重點(diǎn)目前還只是集中在鎮(zhèn)痛基因的選擇、傳遞以及靶組織的選擇3方面[8]。

3.1 疼痛基因治療的可行性基因治療是在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù), 利用該技術(shù)可將人或動(dòng)物的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕? 通過(guò)一定方式轉(zhuǎn)入人體靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá),以糾正基因缺陷或發(fā)揮治療作用, 從而達(dá)到治療疾病的目的。疼痛的基因治療是將一些抗痛基因、調(diào)控因子基因或受體基因等相關(guān)外源基因插入載體中, 加上啟動(dòng)子后導(dǎo)入靶組織細(xì)胞, 使其在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[9,10],通過(guò)增加機(jī)體內(nèi)抗痛基因的表達(dá)而達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的。疼痛的轉(zhuǎn)基因治療避免了傳統(tǒng)用藥時(shí)所產(chǎn)生的不良反應(yīng), 在疼痛治療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

3.2 基因治療的方法[11,12]目前基因治療中常用的有基因置換、基因修復(fù)、基因修飾、基因失活、免疫調(diào)節(jié)等幾種, 基因置換是以正常的基因?qū)牖蛲蛔兊募?xì)胞, 原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因, 從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這是一種理想的治療方法,但由于目前各種試驗(yàn)技術(shù)的限制難以達(dá)到?；蛐迯?fù)也稱(chēng)原位修復(fù),它是參照野生型基因的結(jié)構(gòu), 對(duì)突變的基因進(jìn)行修復(fù), 使突變的基因恢復(fù)正常,從而得到正常的細(xì)胞表達(dá)。 這也是一種理想而直接的基因療法, 但在目前的技術(shù)條件下也很難達(dá)到。基因修飾是將需要的目的基因?qū)霗C(jī)體內(nèi)的病變細(xì)胞或其他細(xì)胞, 導(dǎo)入的目的基因所表達(dá)的產(chǎn)物能夠使原有的一些功能得到加強(qiáng)或彌補(bǔ)缺陷細(xì)胞的功能。此方法是目前基因治療中應(yīng)用最多的一種方法?；蚴Щ钍抢梅戳xRNA、核酸或肽核酸等反義技術(shù)以及RNA干涉技術(shù)等方法, 特異性地封閉機(jī)體內(nèi)某種基因, 從而抑制一些有害基因的表達(dá), 以達(dá)到治療疾病的目的。臨床上常見(jiàn)此方法應(yīng)用于惡性腫瘤的治療。免疫調(diào)節(jié)是將表達(dá)抗原、抗體或細(xì)胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi), 通過(guò)改變病人免疫狀態(tài), 達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 此法常用于惡性腫瘤和感染性疾病的防治。

3.3 疼痛治療中鎮(zhèn)痛基因的選擇3.3.1內(nèi)源性阿片肽 內(nèi)源性阿片肽(endogenous opioid peptides)分為腦啡肽、內(nèi)嗎啡肽、孤啡肽、強(qiáng)啡肽和β -內(nèi)啡肽5大類(lèi), 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)天然生成的具有阿片樣作用的肽類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)。其主要作用就是通過(guò)與機(jī)體內(nèi)阿片類(lèi)受體結(jié)合參與疼痛信息的調(diào)控, 抑制痛信息的傳遞, 從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[13]。不同的內(nèi)源性阿片肽具有不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的氨基酸序列, 在人體內(nèi)有廣泛的分布和多種生物學(xué)效應(yīng)。它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)的功能與阿片類(lèi)藥物的功能相似,首先它們都具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛功能, 腦啡肽、強(qiáng)啡肽、β -內(nèi)啡肽以及最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)嗎啡肽均有明顯的鎮(zhèn)痛作用;機(jī)體內(nèi)的μ、δ和κ阿片受體都參與痛覺(jué)調(diào)制, 目前阿片家族3個(gè)阿片肽前體(前腦啡肽、前強(qiáng)啡肽、前阿黑皮素);3 個(gè)阿片受體即μ受體、δ受體、κ受體的基因已經(jīng)被成功克隆[14,15]。

3.3.2細(xì)胞因子 細(xì)胞因子包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類(lèi)特殊蛋白分子, 它能夠促進(jìn)特定神經(jīng)組織細(xì)胞分化和再生, 并刺激神經(jīng)遞質(zhì)釋放及改變神經(jīng)元特性[16,17],常見(jiàn)的有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、NT-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白(NT)-3 和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)等[18-20]。常用于神經(jīng)損傷或中毒導(dǎo)致的慢性神經(jīng)痛的治療,主要機(jī)制是通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)阿片肽釋放治療疼痛。用BDNF基因治療神經(jīng)痛目前已有成功的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子,常見(jiàn)的有(IL)-10和白介素(IL)-2。前者通過(guò)抑制神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)達(dá)到鎮(zhèn)痛目的, 后者通過(guò)類(lèi)阿片肽作用緩解疼痛。其中IL-2基因治療是由中國(guó)科學(xué)院生化所劉新坦研究組于 2002 年完成, 是國(guó)內(nèi)最早真正意義的疼痛基因治療研究。

3.3.3RNAi 即RNA干涉,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種特殊生物學(xué)現(xiàn)象,是由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它通過(guò)一種小片段干擾性雙鏈RNA作為效應(yīng)分子[21,22], 催化與靶基因mRNA結(jié)合的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而減少的mRNA含量, RNAi廣泛存在于從真菌到高等植物、從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物各種生物中。它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。實(shí)際上就是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的聚合酶鏈反應(yīng)大量擴(kuò)增干擾性RNA, 干擾目的基因的表達(dá), 此項(xiàng)技術(shù)在植物及非脊椎動(dòng)物如線蟲(chóng)、果蠅中的研究中已經(jīng)取得了很多重要的成果, 但在哺乳動(dòng)物中的研究還處于起步階段,目前報(bào)道較少。

3.4 疼痛轉(zhuǎn)基因治療中載體的選擇在基因治療過(guò)程中使用載體有兩個(gè)目的:一是用它作為運(yùn)載工具, 將鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中然后在宿主體內(nèi)表達(dá);二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量的復(fù)制。目前廣泛使用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。

3.4.1病毒載體系統(tǒng) 病毒載體是指用感染性的病毒作為人或者其他哺乳動(dòng)物核苷酸的傳遞系統(tǒng)。它是沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最簡(jiǎn)單、最小的生命寄生體。根據(jù)病毒能高效率地進(jìn)入特定的細(xì)胞類(lèi)型, 表達(dá)自身蛋白并產(chǎn)生新的病毒粒子的特性,將病毒用包裹細(xì)胞包裹, 形成病毒顆粒, 然后感染宿主細(xì)胞并隨機(jī)整合進(jìn)入宿主基因,釋放治療基因。目前科研中常用的有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、痘苗病毒載體 5種載體類(lèi)型。由于存在自身免疫原性和(或)造成細(xì)胞病理改變等缺點(diǎn), 病毒型載體系統(tǒng)目前逐漸被低毒、低免疫反應(yīng)、外源基因整合幾率低的非病毒載體所替代。

3.4.2非病毒載體[23]基因治療載體應(yīng)具備易進(jìn)入細(xì)胞、穩(wěn)定性、安全性、易制備和靶向性等特點(diǎn)。 非病毒載體以其使用簡(jiǎn)單、制備方便、外源基因整合幾率低、無(wú)基因插入片段大小限制以及低毒、低免疫反應(yīng)、便于保存和檢驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注,越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室選擇非病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)作為研究方向。在疼痛的基因治療中理想的非病毒載體需要滿足以下條件:能有效將有活性的基因插入目的區(qū);保護(hù)DNA在進(jìn)入核前不被細(xì)胞內(nèi)溶酶體和酶等降解;保護(hù)DNA不被細(xì)胞外DNA降解酶降解;攜帶DNA穿透細(xì)胞膜;可生物降解, 從細(xì)胞中消除;無(wú)細(xì)胞毒性等。常用的非病毒載體包括細(xì)胞載體、脂質(zhì)體、裸DNA及真核表達(dá)載體。

3.5 基因治療療效觀察為了觀察疼痛基因治療的效果,需要制備慢性疼痛的動(dòng)物模型,常用的慢性疼痛動(dòng)物模型包括:①慢性神經(jīng)痛模型,如捆扎坐骨神經(jīng)根及脊神經(jīng)根;②慢性炎性疼痛模型, 如用40%甲醛、辣椒素注射的關(guān)節(jié)炎模型;③慢性腫瘤疼痛模型。對(duì)疼痛模型動(dòng)物痛覺(jué)變化常用的檢測(cè)方法有痛閾檢測(cè)和行為學(xué)檢測(cè)。痛閾檢測(cè)即檢測(cè)冷熱刺激、機(jī)械刺激時(shí)外周痛閾的變化;行為學(xué)檢測(cè)就是觀察動(dòng)物的行為變化, 模擬人類(lèi)疼痛時(shí)情緒和行為反應(yīng)。

基因治療由Anderson在20 世紀(jì) 80 年代初首先提出,1990年在美國(guó)成功進(jìn)行了ADA(腺昔脫氨酶)缺陷患兒的人體基因治療。慢性疼痛由于涉及到中樞調(diào)控機(jī)理及中樞神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)重塑, 目前主要的治療是靠給麻醉性鎮(zhèn)痛劑和非甾體類(lèi)抗炎藥等, 但這些藥物的耐藥、成癮和其他副作用也限制了其應(yīng)用。在各種普通治療手段及普通藥物對(duì)頑固性疼痛越來(lái)越束手無(wú)策時(shí),基因鎮(zhèn)痛給我們提供了一個(gè)新的疼痛治療方法。隨著人們對(duì)基因治療技術(shù)研究的深入, 以及逐步建立起安全有效的基因調(diào)控體系后, 慢性疼痛的基因治療將可能成為一種安全和有效的治療手段。

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