松仁蛋白多肽對小鼠免疫功能的影響

張立鋼，趙玉紅，李 莉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）為松科，松屬，常綠針葉喬木，是主產(chǎn)于中國小興安嶺的珍貴樹種。紅松籽又稱為海松籽、新羅（朝鮮）松籽[1]。紅松松仁蛋白質(zhì)含量在13%～20%，氨基酸種類齊全，是一種優(yōu)良的植物蛋白源[2]，以紅松松仁為原料生產(chǎn)既有營養(yǎng)性，又有功能性的產(chǎn)品具有廣闊的前景。利用酶水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)生物活性肽是蛋白質(zhì)利用的有效手段之一。生物活性肽具有易消化吸收的特點(diǎn)，不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)成分，還可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能、促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、并有抗氧化、降血壓、降血脂、降膽固醇、護(hù)肝、抗菌等作用[3－4]。研究表明，多種蛋白水解獲得的多肽都具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，能調(diào)動機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，促進(jìn)自身免疫能力的提高。多肽以其分子質(zhì)量低、活性強(qiáng)、用量少的獨(dú)特優(yōu)勢，越來越多地引起人們的重視，其工業(yè)化生產(chǎn)也成為當(dāng)前食品和醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的大趨勢[5]。

目前，對多種不同來源的蛋白酶解獲得生物活性肽進(jìn)行免疫功能研究的報道較多[6－8]，但對松仁蛋白肽相關(guān)研究未見報道。本文研究松仁蛋白多肽對小鼠免疫功能的影響，通過測定免疫器官重量、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核－巨噬細(xì)胞的吞噬功能，測定松仁多肽對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以此作為松仁多肽功能性食品產(chǎn)品開發(fā)利用的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松仁多肽精制品（Pine kernel polypeptide，PKP）實(shí)驗(yàn)室自制；昆明種雄性小鼠購自黑龍江省哈爾濱鐵路局腫瘤醫(yī)院；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）；印度墨汁購自上海長江日用粘合材料廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BPN恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；游標(biāo)卡尺，哈爾濱量具刃具廠；微量注射器，江西僑明醫(yī)療器械有限公司；微量血凝試驗(yàn)板、血色素吸管、計時器等。

1.3 方法

1.3.1 松仁多肽制備工藝流程

松仁粗蛋白→脫脂→酶解→滅酶（100℃，5 min）→離心（4 500 r·min－1，5 min）→上清液→真空冷凍干燥→松仁多肽粗品→復(fù)溶→Sephadex G－25凝膠過濾層析（以0.02 mol·L－1pH 7的磷酸鹽緩沖液洗脫）→冷凍干燥→松仁多肽精制品（PKP）。

1.3.2 試驗(yàn)動物及分組

昆明種雄性小鼠，體重18～20 g。按體重隨機(jī)分為對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組各40只，分別將松仁多肽精制品以150、300、600 mg·kg－1·d－13 個劑量灌胃 3 個試驗(yàn)組，對照組給以同等體積蒸餾水。各組均自由飲水、攝食。

1.3.3 臟器/體重的測定

小鼠飼喂30 d后，稱重，處死，取其肝、脾和胸腺，用濾紙吸干表面血污，稱重，記錄數(shù)據(jù)。按照公式（1）和（2）進(jìn)行計算[9]。

1.3.4 細(xì)胞免疫功能的測定

采用DTH－足跖增厚法（遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)）對小鼠細(xì)胞免疫功能進(jìn)行檢測[10]。

小鼠飼喂30 d后，用體積分?jǐn)?shù)為2%SRBC免疫，每只鼠腹腔注射 0.2 mL（約 1.00×108個SRBC）。免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20%SRBC，每只鼠注射 20 μL（約 1.00×108個 SRBC），于注射后24 h分別測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以處理前后足跖厚度差值（足跖腫脹度）來表示DTH程度。

1.3.5 體液免疫功能的測定

采用血凝法（血清溶血素的測定）對小鼠體液能免疫功能進(jìn)行檢測[11]。

小鼠飼喂30 d后，每只鼠腹腔注射0.2 mL的2%SRBC進(jìn)行免疫，4～5 d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2 000 r·min－1離心 10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝試驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。

血清凝集程度分5級（0－Ⅳ） 記錄，按公式（3）計算抗體積數(shù)，比較受試組和對照組的抗體積數(shù)差異。

式中，1，2，3，……，n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

0級－紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰。

Ⅰ級－紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。

Ⅱ級－凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點(diǎn)。

Ⅲ級－凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點(diǎn)。

Ⅳ級－凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

1.3.6 單核－巨噬細(xì)胞功能的測定

采用小鼠碳廓清試驗(yàn)對小鼠單核－巨噬細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行檢測[12]。

將飼喂30 d的小鼠稱重，尾靜脈注射稀釋的墨汁（每10 g體重注射0.1 mL），立即計時，2 min后用毛細(xì)管從眼眶靜脈叢取血20 μL，迅速將其加入到2 mL Na2CO3溶液中，混勻。以Na2CO3溶液作為空白對照，在600 nm處測定光吸收值（OD1）；10 min后，再次從眼眶靜脈叢取血20 μL，將其加入到2 mL Na2CO3溶液中，測定光吸收值（OD2）。由公式（4）和（5）計算吞噬指數(shù)α值：

式中，t2－tl代表測定的間隔時間（min）。

1.3.7 氨基酸組成的測定

用氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測試中心測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，通過單因素方差分析（One－way ANOVA）來評價結(jié)果的統(tǒng)計差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 松仁肽組成分析

松仁蛋白經(jīng)酶解制得松仁蛋白肽粗品后，利用層析技術(shù)（Sephadex G－25凝膠過濾）進(jìn)行分離制備松仁蛋白多肽，圖1為層析分離結(jié)果。

圖1 Sephadex G-25分離松仁多肽洗脫圖Fig.1 Elution curve of hydrolysates with Sephadex G-25 gel column

由圖1可知，松仁蛋白多肽由PKP1－7共7個組分構(gòu)成。通過對比同一條件下標(biāo)準(zhǔn)蛋白層析結(jié)果可知：PKP1、PKP2組分分子質(zhì)量大于23 105 u，為未充分水解的松仁蛋白；PKP3組分分子質(zhì)量大約為3 776 u，該組分是松仁蛋白多肽；PKP4－7組分分子質(zhì)量低于249 u，由游離氨基酸、二肽或三肽構(gòu)成。

氨基酸組成分析結(jié)果表明，PKP3組分谷氨酸和精氨酸這兩種氨基酸含量相比其他氨基酸豐富，分別為19.98%和16.86%。精氨酸可有效地增強(qiáng)體液免疫，促進(jìn)免疫球蛋白的產(chǎn)生，甚至可以對抗糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用[13－14]。因此對PKP3組分進(jìn)行小鼠免疫功能試驗(yàn)。

2.2 小鼠臟器/體重比

收集PKP3，冷凍干燥得到松仁多肽精制品（PKP）。按照公式（1）和（2）計算灌喂30 d后臟體比。結(jié)果見表1。由表1可知，松仁多肽對小鼠臟器重量和臟體比有影響。PKP高劑量組小鼠脾臟重和脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），中劑量組脾臟指標(biāo)高于對照組，但差異不顯著；PKP中、高劑量組小鼠胸腺重和胸腺指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），高劑量組胸腺指數(shù)與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。由試驗(yàn)結(jié)果可見，中劑量（300 mg·kg－1·d－1）攝入即可引起小鼠免疫器官的顯著變化。

表1 PKP對小鼠免疫器官重量的影響Table 1 Effects of PKP on weights of immune organs in mice(±S,n=10)

表1 PKP對小鼠免疫器官重量的影響Table 1 Effects of PKP on weights of immune organs in mice(±S,n=10)

注：*代表差異顯著（P＜0.05）；**代表差異極顯著（P＜0.01）。以下同。Note:*denote significant difference at 0.05 level;**denote extremely significant difference at 0.01 level.The same as below.

脾臟Spleen組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1脾臟重（g）Spleen weight 0.1528±0.0210 300 mg·kg－1·d－1 0.1427±0.0212 0.1625±0.0179 600 mg·kg－1·d－10.2120±0.0150*脾臟指數(shù)（%）Spleen index 0.5441±0.0755 0.5320±0.0467 0.5962±0.0295 0.8002±0.1291*胸腺Thymus胸腺重（g）Thymus weight 0.0588±0.0070 0.0640±0.0015 0.0870±0.0111*0.0892±0.0120*胸腺指數(shù)（%）Thymus index 0.2074±0.0273 0.2209±0.0144 0.3235±0.0109*0.3334±0.0023**

2.3 小鼠細(xì)胞免疫功能

采用DTH－足跖增厚法（遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)）測定PKP對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，結(jié)果見表2。

表2PKP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響Table 2 Effects of PKP on delayed type hypersensitivity reaction(DTH)in mice(±S,n=10)

表2PKP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響Table 2 Effects of PKP on delayed type hypersensitivity reaction(DTH)in mice(±S,n=10)

組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1 24 h足跖增厚（cm）Increased metatarsus thickness,after treatment 24 h 0.0253±0.0260 300 mg·kg－1·d－1 0.0614±0.0220*0.0621±0.0190*600 mg·kg－1·d－10.0600±0.0290*

由表2可知，試驗(yàn)組小鼠在攝入PKP 30 d之后，表現(xiàn)出對SRBC誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的增強(qiáng)作用，表現(xiàn)在24 h后足跖的增厚，3個試驗(yàn)組中中等劑量組（300 mg·kg－1·d－1）足跖增厚最高。低劑量組（150 mg·kg－1·d－1）、中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）和高劑量組（600 mg·kg－1·d－1）在處理 24 h 后足跖增厚高于對照組（P＜0.05）。由試驗(yàn)結(jié)果可知，PKP對SRBC誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有促進(jìn)作用，可作為免疫促進(jìn)劑對小鼠的細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生影響。

2.4 小鼠體液免疫功能

采用血凝法（血清溶血素測定）測定PKP對小鼠體液免疫功能的影響，根據(jù)血清凝集程度的級別，按公式（3）計算抗體積數(shù)，比較受試組和對照組的抗體積數(shù)差異?？贵w積數(shù)越大，表示血清抗體越高。結(jié)果見表3。

表3 PKP對小鼠體液免疫功能的影響Table 3 Effects of PKP on humoral immunity function in mice(±S,n=10)

表3 PKP對小鼠體液免疫功能的影響Table 3 Effects of PKP on humoral immunity function in mice(±S,n=10)

組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1血清溶血素Serum hemolysin 19±1.2 300 mg·kg－1·d－1 39±3.5**45±2.4**600 mg·kg－1·d－148±4.5**

由表3可知，PKP攝入使小鼠的血清在更高的稀釋度下使SRBC凝集，即具有更高的抗體水平，隨著劑量的增高，抗體積數(shù)增加。試驗(yàn)組（150、300 和 600 mg·kg－1·d－1）小鼠的抗體積數(shù) （血清凝血素水平）高于對照組（P＜0.01）?？梢?，PKP能增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。

2.5 小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能

采用小鼠碳廓清試驗(yàn)測定PKP攝入對小鼠單核－巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。由公式（4）、（5）計算吞噬指數(shù)α值，以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力，結(jié)果見表4。

表4 PKP對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Table 4 Effects of PKP on macrophage phagocytosis function of the mice(Xˉ±S,n=10)

由表4可知，PKP攝入對小鼠的單核－巨噬細(xì)胞的吞噬功能有影響，試驗(yàn)組吞噬指數(shù)高于對照組。中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）小鼠的吞噬指數(shù)最高，吞噬功能最強(qiáng)，其次為低劑量組，再次為高劑量組。中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）?？梢?，中等劑量PKP可提高小鼠的單核－巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

3討 論

3.1 松仁多肽的構(gòu)成與免疫功能的關(guān)系

松仁蛋白經(jīng)酶解可以制得不同分子質(zhì)量的肽，經(jīng)凝膠過濾層析得到的松仁多肽，主要組分分子質(zhì)量大約為3 776 u。多肽氨基酸構(gòu)成與對于機(jī)體的免疫功能有關(guān)，精氨酸對機(jī)體免疫具有調(diào)節(jié)功能，主要是通過精氨酸－NO途徑以及對內(nèi)分泌激素的影響實(shí)現(xiàn)[14]，精氨酸可促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，引起胸腺重量增加增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)體液免疫，促進(jìn)免疫球蛋白產(chǎn)生。松仁多肽的氨基酸分析結(jié)果表明，層析分離的7個組分中，松仁多肽PKP3中精氨酸含量高達(dá)16.86%，針對這一組分進(jìn)行免疫功能研究，符合本研究的目標(biāo)和進(jìn)行深入研究松仁蛋白功能性實(shí)際意義。

3.2 松仁多肽對小鼠免疫器官的影響

免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)擔(dān)負(fù)免疫功能的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子構(gòu)成，它們是機(jī)體免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫器官按作用不同，分為中樞免疫器官和外周免疫器官。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是外周免疫器官，二者均是體內(nèi)的主要免疫器官，與體液免疫和細(xì)胞免疫均有密切關(guān)系[15]。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小直接反映機(jī)體免疫水平的高低。

在本研究中，PKP的攝入能顯著增大小鼠免疫器官，這與其他肽制備物對小鼠免疫功能的影響相似，如紅三葉寡肽也使小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)增加[16]。中等劑量使小鼠胸腺指數(shù)增高，而高劑量同時增加脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。這種現(xiàn)象可以看作松仁多肽對免疫器官直接刺激的結(jié)果。兩指數(shù)都增加，說明PKP對細(xì)胞免疫和體液免疫都有促進(jìn)作用。

3.3 松仁多肽對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)又稱“遲發(fā)型超敏反應(yīng)”，屬IV型變態(tài)反應(yīng)，是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)，無需抗體或補(bǔ)體參加，在變應(yīng)原作用下形成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸相同變應(yīng)原時，表現(xiàn)出一種遲緩的、以單個核細(xì)胞浸潤和細(xì)胞變性壞死為特征的局部變態(tài)反應(yīng)性炎癥，在24～48 h達(dá)到高峰然后逐漸消退。

本研究中以足跖厚度變化值來表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度，PKP的攝入使小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)，低、中和高劑量組小鼠的足跖變化顯著高于對照組。各劑量組引起的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)在中等劑量時最強(qiáng)。

3.4 松仁多肽對小鼠體液免疫功能的影響

抗體是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，具有結(jié)合抗原和激活補(bǔ)體等多種生物學(xué)功能，血清抗體水平可反映機(jī)體免疫力的高低。

血清中溶血素含量的高低是衡量體液免疫的重要指標(biāo)[17－18]。通過測定血清中溶血素（抗體）含量即可反映出食源性生物活性肽對體液免疫的影響。在肽對于小鼠免疫功能研究中，紅三葉寡肽可以顯著提高小鼠體液免疫功能[16]，本研究中，PKP的攝入使小鼠的體液免疫水平提高（P＜0.01），表明PKP是調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答水平的重要物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的生成發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。

3.5 松仁多肽對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

單核－巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一[19]。當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可被單核－巨噬系統(tǒng)迅速吞噬和清除，因而巨噬細(xì)胞廓清指數(shù)可以反映其吞噬功能的強(qiáng)弱[8]。巨噬細(xì)胞有吞噬、處理和呈遞抗原，激活淋巴細(xì)胞和分泌多種可溶性因子以加強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性的功能，參與免疫反應(yīng)的傳入支；同時它也是免疫效應(yīng)細(xì)胞，能殺死細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞，引起組織損傷，而參與免疫反應(yīng)的傳出支。在免疫反應(yīng)中，免疫細(xì)胞通過直接接觸和它們分泌的可溶性因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)PKP攝入引起的小鼠單核－巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出隨著PKP攝入劑量升高而出現(xiàn)先升高再降低的趨勢，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，這種變化趨勢與酶解雞蛋清小肽混合物對小鼠免疫功能的影響相似[20]。對于松仁多肽，在中等劑量時，單核－巨噬細(xì)胞功能增強(qiáng)相比對照組達(dá)到顯著水平。這表明，適當(dāng)劑量的松仁多肽對小鼠非特異免疫功能有提高作用。

4 結(jié)論

松仁蛋白多肽對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)功能，表現(xiàn)出增加正常小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能，由此可認(rèn)為松仁蛋白多肽能增強(qiáng)小鼠免疫功能。

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