大鼠動(dòng)脈內(nèi)局部低溫腦梗死模型的建立和特點(diǎn)*

趙沃華 吉訓(xùn)明 凌 鋒 吳 浩 趙洪洋 朱賢立

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科,武漢 430022

2首都醫(yī)科大學(xué)北京宣武醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100085

為模擬臨床上動(dòng)脈內(nèi)溶栓和藥物灌洗治療,我們根據(jù)經(jīng)典實(shí)心線栓大腦中動(dòng)脈(middle cerebral atery,MCA)缺血模型的制作方法[1],利用特制的帶導(dǎo)絲的中空管,制作了中空管線栓MCA缺血模型,并觀察了經(jīng)中空管灌洗冷生理鹽水達(dá)到腦局部低溫的效果。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

30只成年雄性SD大鼠,體重260～300 g,分為經(jīng)典線栓組、中空管線栓組和低溫鹽水灌洗組。實(shí)驗(yàn)前1 d晚上開(kāi)始禁食不禁水。大鼠經(jīng)口氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)(Model 683,Harvard儀器公司,美國(guó))和麻醉機(jī)(Model 61010,A.M Bickford公司,美國(guó))。麻醉劑選用3.5%恩氟烷,混合于70%一氧化氮和30%氧氣的混合氣體中。肌肉注射維庫(kù)溴銨(Norcuron,萬(wàn)可松,0.6 mg/kg)維持麻醉狀態(tài)。右側(cè)股動(dòng)脈置PE-50管,與壓力感受器連接,持續(xù)記錄平均動(dòng)脈壓。定期監(jiān)測(cè)大鼠血?dú)?248 pH血?dú)夥治鰞x,Chiron Diagnostics Limited,英國(guó))和血糖(ACCU-CHEK Active GN 03173351,羅氏公司,德國(guó))。大鼠置于小動(dòng)物控溫毯(TCAT-2AC,Harvard儀器公司,英國(guó))及特制顳肌溫度反饋加熱頭燈下。在整個(gè)手術(shù)操作過(guò)程中維持直腸溫度在37.5℃,右側(cè)顳肌溫度維持在37℃。

1.2 經(jīng)典線栓MCA缺血模型制作

根據(jù)Longa等[1]的方法,略作改動(dòng)。顯露和游離右側(cè)頸總動(dòng)脈主干及頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈近端。電凝后切斷右側(cè)頸外動(dòng)脈近分叉處分支,3-0絲線于頸外動(dòng)脈分叉處15～20 mm結(jié)扎并切斷頸外動(dòng)脈。微型動(dòng)脈夾臨時(shí)阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈血流。選取外徑0.24 mm的prolene線段,經(jīng)頸外動(dòng)脈殘端插入。插入深度約為18～21 mm,根據(jù)腦血流量監(jiān)測(cè)結(jié)果監(jiān)測(cè)線栓是否到位。線栓到位后,在頸外動(dòng)脈殘端處結(jié)扎固定線栓。松開(kāi)頸總動(dòng)脈微型動(dòng)脈夾。要求頸總動(dòng)脈血流臨時(shí)阻斷時(shí)間＜5 min?？p合皮膚。缺血2 h后,大鼠再次麻醉,拔除線栓,使血液再灌注,頸外動(dòng)脈殘端結(jié)扎,皮膚縫合。

1.3 中空管線栓MCA缺血模型制作

用特制的中空管線栓替代傳統(tǒng)實(shí)心線栓制作MCA缺血模型。30 mm長(zhǎng)的PE50管,一端在酒精燈下烤熱并拉伸,用螺旋測(cè)微器測(cè)量頭端直徑,選取頭端直徑為0.24 mm的栓子,內(nèi)腔以恰好通過(guò)直徑0.11 mm的尼龍線為宜。頭端修剪為長(zhǎng)25 mm,尾端為正常PE50管,長(zhǎng)度為5 mm;內(nèi)腔注入肝素化生理鹽水,再插入長(zhǎng)35 mm,直徑為0.11 mm尼龍線,浸泡在肝素化鹽水中,作為中空管線栓。模型制作方法同經(jīng)典線栓組。

1.4 局部生理鹽水灌洗模型制作

如上法制作中空管線栓MCA缺血模型,在血液再灌注之前10 min,將中空管線栓向后拔出約2～3 mm,拔出中空管內(nèi)的尼龍線,以微量泵向中空管內(nèi)注入20℃生理鹽水約6 mL(泵入速度為0.6 mL/min,持續(xù)約10 min)。在向動(dòng)脈內(nèi)灌洗生理鹽水時(shí),頸總動(dòng)脈血流以微型動(dòng)脈夾臨時(shí)阻斷。灌洗結(jié)束后,撤除右側(cè)頸總動(dòng)脈臨時(shí)阻斷夾,拔除中空管線栓,使血液再通。頸外動(dòng)脈殘端結(jié)扎。

1.5 局部腦血流量的測(cè)定

應(yīng)用激光血流測(cè)定儀(PeriFlux System 5000,Perimed AB公司,瑞典),對(duì)右側(cè)MCA供血區(qū)皮質(zhì)血流進(jìn)行測(cè)定。大鼠麻醉后,在前囟后方3 mm,外側(cè)3 mm以高速磨鉆鉆孔。將塑料測(cè)量電極固定器以EC耳腦膠牢固固定于大鼠顱骨上。在缺血開(kāi)始前測(cè)定腦血流的基線值。當(dāng)線栓到位時(shí),腦血流測(cè)定值至少需降至基線值的25%以下。未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠排除在實(shí)驗(yàn)組之外。

1.6 腦溫監(jiān)測(cè)

皮質(zhì)測(cè)溫點(diǎn)選取前囟外側(cè)3 mm處,深度約3 mm;髓質(zhì)測(cè)溫點(diǎn)選取前囟后方3 mm,外側(cè)5 mm,深度約5 mm。將針狀測(cè)溫電極插入,連接測(cè)溫儀(Physitemp儀器公司,美國(guó));在動(dòng)脈內(nèi)生理鹽水灌洗前,灌洗過(guò)程中和灌洗后 60 min內(nèi),觀察右側(cè)MCA供血區(qū)腦組織溫度。

1.7 神經(jīng)功能評(píng)定

在大鼠缺血前、缺血中(缺血開(kāi)始后1 h)、缺血后24和48 h分別對(duì)大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定。采用Belayev等[2]推薦的十二分法對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定。神經(jīng)功能評(píng)分為0～12分,正常是0分,最高12分。

1.8 腦梗死體積的測(cè)定

腦缺血48 h后,大鼠以過(guò)量苯巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛心臟灌注。大鼠腦組織置于特制大鼠腦冠狀切片適配器上,從前到后(從額極至枕極)取冠狀切片6片。腦組織置于溫四氮唑紅(tetrazolium chloride,TTC)溶液中染色15～30 min。數(shù)碼相機(jī)照相,以圖像分析軟件Image Proplus 5.0測(cè)量腦梗死體積。為減少腦水腫造成的誤差,采用Swanson等[3]推薦的間接法進(jìn)行腦梗死體積的計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo)

平均動(dòng)脈壓、直腸溫度、血糖水平和血?dú)庵笜?biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持在基本正常水平。各實(shí)驗(yàn)組之間的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。在應(yīng)用低溫鹽水灌洗時(shí),顳肌溫度和直腸溫度略有下降,但也維持在36.5℃以上;停止低溫鹽水灌洗后,逐漸恢復(fù)至正常水平。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分

中空管線栓缺血組大鼠在缺血后1、24和48 h的神經(jīng)功能評(píng)分[分別為(10.10±0.82),(6.10±1.20)和(4.30±1.34)]同經(jīng)典線栓缺血組各時(shí)間段神經(jīng)功能評(píng)分[分別為(9.60±1.17),(6.10±1.20)和(4.90±1.45)]相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.258,1.000,0.291);低溫鹽水灌洗組1 h時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分(10.00±0.82),與同時(shí)間段中空管線栓組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.819),而24和48 h神經(jīng)功能評(píng)分[分別為(2.30±1.16)和(1.90±0.88)]與同時(shí)間段中空管線栓組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。

2.3 腦溫監(jiān)測(cè)

在低溫鹽水灌洗組中,在血液再灌注之前,經(jīng)中空管注入20℃冷生理鹽水,MCA供血區(qū)皮質(zhì)溫度從(37.0±0.1)℃降低至(32.8±0.2)℃,髓質(zhì)溫度從(37.5±0.1)℃降低至(33.2±0.3)℃。

2.4 腦梗死體積

經(jīng)典線栓組和中空管線栓組的腦梗死范圍類似,均位于同側(cè)的顳頂部。中空管線栓組的腦梗死體積[(41.81±2.88)%]同經(jīng)典線栓組[(41.92±2.17)%]相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.922);而低溫鹽水灌洗組腦梗死體積[(22.37±1.86)%]同中空管線栓組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

我們模擬臨床上動(dòng)脈內(nèi)溶栓的方法,建立了大鼠中空管線栓MCA腦缺血模型。當(dāng)線栓堵塞MCA開(kāi)口處,可以造成MCA供血區(qū)缺血;拔除中空管線栓,可以使血液再灌注。當(dāng)回拉線栓1～2 mm,抽出中空管內(nèi)導(dǎo)絲,經(jīng)中空管向MCA供血區(qū)注入冷生理鹽水,可以達(dá)到缺血區(qū)腦局部低溫。

目前應(yīng)用最廣泛的MCA缺血模型是Longa等[1]所改進(jìn)的線栓MCA缺血模型,具有無(wú)需開(kāi)顱、操作簡(jiǎn)單、梗死體積穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點(diǎn)。我們改良的模型,以中空管線栓,代替?zhèn)鹘y(tǒng)線栓,能更好地模擬臨床上介入治療急性腦缺血的過(guò)程。同傳統(tǒng)線栓模型相比,中空管線栓模型能夠產(chǎn)生類似的神經(jīng)功能癥狀,腦梗死的范圍和體積也基本相同。

急性MCA閉塞靜脈內(nèi)溶栓建議在癥狀開(kāi)始3 h之內(nèi)進(jìn)行,動(dòng)脈內(nèi)溶栓建議在癥狀開(kāi)始6 h之內(nèi)進(jìn)行;否則,過(guò)長(zhǎng)的缺血時(shí)間可能加重腦水腫,并增加腦出血的風(fēng)險(xiǎn)[4]。動(dòng)脈內(nèi)溶栓治療是將高濃度的溶栓藥物直接應(yīng)用于血栓處,較靜脈內(nèi)溶栓能夠降低溶栓藥物濃度,增加血管再通率,減少溶栓藥物的副作用[4]。雖然動(dòng)脈內(nèi)溶栓治療需要在發(fā)病后盡早進(jìn)行,但很多患者到達(dá)醫(yī)院時(shí),已經(jīng)超過(guò)了溶栓治療的時(shí)間窗,失去了最佳的治療時(shí)機(jī)[4-5]。因此,盡可能延長(zhǎng)動(dòng)脈內(nèi)治療的時(shí)間窗是缺血性腦血管病治療的重要方面。

在對(duì)缺血性腦損害的研究中,低溫治療是目前唯一在實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究均證實(shí)對(duì)人有效的神經(jīng)保護(hù)措施[6]。目前,誘導(dǎo)低溫的方法主要包括身體表面應(yīng)用冰毯,冷空氣降溫,乙醇皮膚擦浴,或者在頭部、腹股溝、腋窩和頸部放置冰袋等。也有介紹應(yīng)用靜脈內(nèi)熱交換機(jī)應(yīng)用于臨床誘導(dǎo)全身低溫的報(bào)道[7]。但是應(yīng)用這些方法,為了誘導(dǎo)和維持靶點(diǎn)溫度,需要耗費(fèi)醫(yī)務(wù)人員大量的精力,并可能引起嚴(yán)重并發(fā)癥,如心律失常、寒顫、感染和凝血功能障礙等。

應(yīng)用我們的方法,達(dá)到的動(dòng)脈內(nèi)局部低溫具有以下特點(diǎn):

①動(dòng)脈內(nèi)局部低溫是僅對(duì)缺血局部腦區(qū)的低溫。局部頭部低溫同全身低溫相比,效果類似,但并發(fā)癥更少。我們所用的局部動(dòng)脈內(nèi)低溫的方法,是對(duì)局部缺血腦區(qū)的低溫,對(duì)側(cè)腦組織溫度變化相對(duì)較小,對(duì)全身溫度的影響就更小。

②20℃低溫生理鹽水局部動(dòng)脈內(nèi)灌洗可達(dá)到輕度低溫。雖然中度低溫和深低溫具有明顯的保護(hù)作用,但也有很多的副作用,如心律失常、寒顫、肺部感染等。輕度低溫的治療效果可能不如重度低溫,但是并發(fā)癥明顯減少。在我們的實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用20℃生理鹽水灌洗達(dá)到的低溫屬于輕度低溫的范圍。Ding等[8]的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用類似方法,缺血區(qū)皮質(zhì)和髓質(zhì)溫度分別降低至33.4和33.9℃。

③動(dòng)脈內(nèi)局部低溫開(kāi)始于血液再灌注之前。目前現(xiàn)有的低溫實(shí)施時(shí)機(jī)有缺血期低溫、再灌注期低溫和缺血期持續(xù)至再灌注期低溫。缺血發(fā)生當(dāng)時(shí)就實(shí)施低溫在理論上和實(shí)驗(yàn)中是可行的,但在臨床實(shí)際工作中往往是很難做到的?；颊叽蠖际窃诎l(fā)病后就診的,有一個(gè)就診的過(guò)程,所以無(wú)法在缺血當(dāng)時(shí)就實(shí)施低溫。在實(shí)驗(yàn)研究中,開(kāi)始應(yīng)用低溫治療的時(shí)機(jī)不一。一般認(rèn)為,低溫應(yīng)用得越晚,效果就可能越差。

④動(dòng)脈內(nèi)局部低溫持續(xù)時(shí)間約1 h。在先前的研究中,低溫的持續(xù)時(shí)間多在1～3 h之間。研究發(fā)現(xiàn),較長(zhǎng)時(shí)間的低溫,能更明顯減少腦梗死體積。我們所應(yīng)用的局部動(dòng)脈內(nèi)低溫,持續(xù)時(shí)間約1 h左右。

⑤局部鹽水灌洗可能在預(yù)防缺血再灌注損傷方面也具有一定的作用。Ding等[9]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用37℃常溫鹽水動(dòng)脈內(nèi)灌洗,能夠減少缺血腦組織細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的表達(dá)和減少白細(xì)胞向缺血區(qū)域的浸潤(rùn)。而ICAM-1是急性炎癥反應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物,能夠誘導(dǎo)血液中的白細(xì)胞向缺血區(qū)浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦梗死體積的減少和神經(jīng)功能評(píng)分的好轉(zhuǎn),也有可能是局部鹽水灌洗,減少了再灌注損傷引起的炎性反應(yīng)。

臨床上,借助導(dǎo)管可以到達(dá)急性梗塞的腦血管(最常見(jiàn)是MCA),進(jìn)行機(jī)械溶栓或者抽吸血凝塊。通過(guò)微導(dǎo)管也可以經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)給予溶栓藥物。機(jī)械性溶栓,可以機(jī)械粉碎血凝塊,同時(shí)結(jié)合藥物溶栓的方法,也已經(jīng)應(yīng)用于臨床。在血液再灌注之前,導(dǎo)管通過(guò)梗塞部位,到達(dá)梗塞血管的遠(yuǎn)端,先進(jìn)行缺血局部鹽水灌洗的方法是可行的。由于人的血管比大鼠的血管管徑要粗得多,在臨床上應(yīng)用動(dòng)脈內(nèi)局部灌洗相對(duì)要容易很多。這種方法同樣為低溫治療聯(lián)合血管內(nèi)藥物治療,提供了新的途徑。

[1] Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversi-ble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2] Belay ev L,Alonso O F,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture.Neurological and pathological evaluation of an improved model[J].Stroke,1996,27(9):1616-1622.

[3] Swanson R A,Morton M T,T sao-Wu G,et al.A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J].J Cereb Blood Flow Metab,1990,10(2):290-293.

[4] Jahan R.Hyperacute therapy of acute ischemic stroke:intraarterialthrombolysis and mechanicalrevascularization strategies[J].Tech Vasc Interv Radiol,2005,8(2):87-91.

[5] Hacke W,Brott T,Caplan L,et al.Thrombolysis in acute ischemic stroke:controlled trials and clinical experience[J].Neurology,1999,53(7 Suppl 4):S3-S14.

[6] Bernard S A,G ray T W,Buist M D,et al.Treatment of comatose survivors of out-of-hospital cardiac arrest with induced hypothermia[J].N Engl J Med,2002,346(8):557-563.

[7] Krieger D W,De Georgia M A,Abou-Chebl A,et al.Cooling for acute ischemic brain damage(cool aid):an open pilot study of induced hy pothermia in acute ischemic stroke[J].Stroke,2001,32(8):1847-1854.

[8] Ding Y,Li J,Luan X,et al.Local saline infusion into ischemic territo ry induces regional brain cooling and neuroprotection in rats with transient middle cerebral artery occlusion[J].Neurosurgery,2004,54(4):956-964.

[9] Ding Y,Young C N,Li J,et al.Reduced inflammato ry mediator expression by pre-reperfusion infusion into ischemic territory in rats:a real-time polymerase chain reaction analysis[J].Neurosci Lett,2003,353(3):173-176.