日本腦炎診斷技術研究進展*

裴國順,馮若飛,2,侯蘭新*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030;

2.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室,甘肅蘭州 730030)

日本腦炎診斷技術研究進展*

裴國順1,馮若飛1,2,侯蘭新1*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030;

2.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室,甘肅蘭州 730030)

日本腦炎是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)以及人類健康的蟲媒病,每年造成大量的經濟損失。為了更好地控制與預防該病,及時的診斷尤為重要。用于日本腦炎診斷的技術主要有病毒分離與鑒定、血清學診斷技術及分子生物學技術等。由于每種診斷技術都有其優(yōu)勢和不足之處,所以應根據具體情況選擇合適的診斷方法。論文就各種診斷技術的原理、特點進行概述,并對日本腦炎診斷技術的發(fā)展趨勢進行展望。

日本腦炎;免疫熒光;診斷;聚合酶鏈反應;酶聯免疫吸附試驗

*通訊作者

流行性乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),經蚊子(主要是三角喙蚊)傳播能引起人畜患乙型腦炎(乙腦),該病最早在日本發(fā)現,是一種人獸共患的自然疫源性疾病[1-2]。本病主要分布于亞洲及西太平洋地區(qū),在亞洲又以中國及東南亞地區(qū)流行較為嚴重,我國是日本腦炎流行的高發(fā)地區(qū),除新疆、西藏和青海等地外,各省(區(qū))均有發(fā)生[3]。日本腦炎的致死率在20%左右,重型患者病后常留有后遺癥[4]。因此,對日本腦炎診斷方法的研究具有重要意義。近年來我國在日本腦炎的診斷方法上進行了不少研究,現將取得的進展概述如下。

1 病毒分離與鑒定

病毒分離與鑒定是診斷日本腦炎最確切、可靠的一種方法。通過接種JEV敏感細胞,如金黃色地鼠腎細胞、白蚊 C(C6/36)、BHK-21和Vero細胞等,觀察細胞是否病變。經分離培養(yǎng)取得毒株,進行分子生物學等鑒定,可研究其基因型,是否本地區(qū)主要流行株或外來輸入株,是否發(fā)生變異等。王俊文等[5]用BHK-21細胞成功分離到2株JEV,分別命名為 LN022102和 LN022104。

2 血清學診斷技術

2.1 傳統(tǒng)血清學方法

2.1.1 補體結合試驗 補體結合試驗(complement fixation test,CFT)是以已知抗原(或抗體)和待檢抗體(或抗原)作為待檢系統(tǒng),以綿羊紅細胞(SRBC)與相應抗體(溶血素)組成指示系統(tǒng)。在試驗過程中,補體先與待檢系統(tǒng)反應,如果待檢系統(tǒng)中抗原與抗體相對應,則結合形成免疫復合物,可優(yōu)先結合補體,這樣補體就不再與指示系統(tǒng)中的致敏紅細胞反應,所以不發(fā)生溶血;反之,若待檢系統(tǒng)中抗原與抗體不相對應,則發(fā)生溶血現象。因此,可以根據溶血的出現與否,定性或定量檢測抗體或抗原。

2.1.2 血清中和試驗 血清中和試驗(serum neutralization test,SN)是利用患病動物血清中含有抗體,能與JEV結合特性,使病毒失去感染細胞的能力,從而阻斷病毒的繁殖。通過對敏感細胞的接種,比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染能力,可對JEV進行鑒定。

2.1.3 空斑減少中和試驗 空斑減少中和試驗(plaque reduction neutralization test)是一種經典的中和抗體的測定方法,靈敏度遠高于血凝抑制試驗,重復性較好,可真實地反映血清抗體中和JEV的能力。武果桃等[6]通過JEV空斑減少中和試驗和反向被動血凝抑制試驗,證明空斑減少中和試驗的陽性檢出率高于反向被動血凝抑制試驗。

2.1.4 血凝抑制試驗 血凝抑制試驗(HI)是流行病學調查和臨床診斷中最常用的方法,JEV感染后,HI抗體出現較早,一般在病后4 d～5 d開始出現,2周左右達到高峰,并可維持1周左右,因此測定HI抗體可用于早期診斷。

2.2 新型SPA協(xié)同凝集試驗

金黃色葡萄球菌的細胞壁內含有葡萄球菌A蛋白(SPA),能與人及多種哺乳動物血清中IgG類抗體的FC段非特異性結合,IgG的FC段與SPA結合后,兩個Fab段暴露在葡萄球菌菌體表面,仍保持其結合抗原的活性和特異性,當其與特異性抗原相遇時,能出現特異的凝集現象。新型SPA協(xié)同凝集試驗(SPA-CoA)主要利用這一特征實現對微生物的快速診斷、定種及定型,以及傳染病的早期診斷。宋大偉等[7]利用SPA-CoA試驗對144份豬血清進行了JEV抗體檢測,并與HI試驗進行對比,結果顯示,HI檢測陽性率為57.63%,新型SPA-CoA陽性率為63.89%;二者陽性符合率87.00%,總符合率為88.89%,表明新型SPA-CoA比HI試驗簡便實用。

2.3 免疫熒光技術 免疫熒光檢測法是一種將抗原、抗體的結合反應與形態(tài)學相結合的方法,該法把血清學的特異性、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為一體,擴大了免疫學診斷的結果。目前擁有乙腦診斷的免疫熒光技術包括間接免疫熒光法,直接免疫熒光法和微量免疫熒光法。

2.3.1 直接免疫熒光法 將熒光素標記在相應的JEV抗體上,直接與JEV反應。標記熒光素的抗體與抗原反應后,在紫外光的照射下,用顯微鏡可觀察到熒光現象。該法具有簡便、特異性高,非特異性熒光染色少等優(yōu)點;缺點是敏感性偏低,且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。

2.3.2 間接免疫熒光法 間接免疫熒光法(indirect fluorescent antibody test,IFA)與間接ELISA相似,引入酶標二抗,可檢測抗原,也可檢測抗體。它比直接法易出現非特異熒光,由于一抗可以結合多個標記二抗,故敏感度比直接法高[8]。朱兆奎等[9]用所建立的檢測豬血清中 JEV IgG抗體的IFA,對50份母豬、55份仔豬和65份屠宰豬的血清進行檢測,日本腦炎血清抗體效價≥1∶200的分別為88.00%,10.91%和24.62%。表明該方法能較好的用于豬血清日本腦炎流行病學調查

2.3.3 微量免疫熒光法 微量免疫熒光法(microimmunofluorescence,MIF)是 Wang S P在20世紀70年代建立的,主要用于血清流行病學的研究,對臨床診斷也有極大幫助。MIF具有特異特異性強,敏感性高等優(yōu)點,可對日本腦炎患者的急性期血清進行特異性檢測。

2.4 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzyme techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種免疫測定技術,是一種最常用的固相酶免疫測定方法。ELISA的基本原理是用酶標記的抗原或酶標記的抗體為主要試劑,通過復合物中的酶催化底物呈色反應來對被測物進行定性或定量檢測。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,ELISA可分為:捕獲包被法測抗體,雙抗體夾心法測抗原、雙抗原夾心法測抗體、間接法檢測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原等6種類型。由于ELISA方法的快速、高效等優(yōu)越性,目前該方法已經被廣泛用于日本腦炎抗原或抗體檢測。

2.4.1 捕獲包被法測抗體 捕獲法亦稱反向間接法,主要用于測定血清中某種抗體亞型成分,其操作步驟為:用已知特異性第二抗體包被固相載體;加待檢標本,經溫育使相應抗體與固相二抗結合,洗滌除去無關物質;加入特異抗原和抗原特異的酶標抗體,溫育,洗滌除去未結合的抗原和酶標抗體;加底物顯色,終止反應后,用酶標儀測OD值定量[10]。

2.4.2 雙抗體夾心ELISA測抗原 該法屬于非競爭結合測定,它是檢測抗原最常用的ELISA,適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。其步驟為將抗體包被到固相載體上,加入待測抗原,反應一段時間,洗去沒有與抗體吸附的抗原,再加入酶標抗體,經一段時間后洗去多余的酶標抗體,加底物顯色,經終止液終止后,酶標儀檢測確定待測抗原。張小兵等[11]利用單克隆抗體和酶標多克隆抗體配對,用含動物血清的稀釋液稀釋酶標抗體,實現了對待檢抗原的高特異性和高靈敏度檢測。

2.4.3 雙抗原夾心ELISA測抗體 把JEV抗原固定在固相上,加入待測抗體,反應一段時間后洗板,加入酶標抗原,37℃孵育一段時間再次洗板,經顯色,酶標儀檢測可確定是否有待測抗原。

2.4.4 間接ELISA法 此法是測定抗體最常用的方法,其原理是將抗原連接到固相載體上,待測抗體與之結合生成附著在固相上的抗原-抗體復合物,用酶標二抗與固相免疫復合物中的抗體結合,形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復合物,加底物顯色,經終止液終止后,酶標儀檢測確定待測抗體。孫虹等[12]用該法對1 318份豬群血清樣本進行檢測,獲得JEV IgG抗體陽性血清 489份,總陽性率為37.1%。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展,近年來以基因工程重組表達抗原作為診斷制劑建立的診斷新技術已顯示出獨特的優(yōu)越性。張雪寒等[13]把JEV的E基因經過體外昆蟲細胞表達,獲得抗原性良好的蛋白作為診斷抗原,用其建立的間接ELISA方法能很好地用于豬群JEV抗體水平的檢測。

2.4.5 競爭法測抗體 待測抗體與酶標抗體競爭與固相抗原結合,樣品中抗體愈多,結合到固相抗原上的酶標抗體就越少,顯色就愈淺。步驟為:先用特異抗原包被固相載體并封閉,同時加入待測樣本和酶標抗體,孵育一定時間后洗板,加入酶底物,孵育顯色測定。顯色深為陰性,顯色淺或不顯色為陽性。

2.4.6 競爭法測抗原 待測抗原與酶標抗原競爭與固相抗體結合,樣品中抗原愈多,結合到固相抗體上的酶標抗原就越少,顯示就愈淺。步驟為:先用特異抗體包被固相載體并封閉,同時加入待測樣本和酶標抗原,孵育一定時間后洗板,加入酶底物,孵育顯色測定。顯色深為陰性,顯色淺或不顯色為陽性。

2.5 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術(immunocolloidal gold,ICG)是一種常見的標記技術,自1971年Faulk和Taylon用兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結合、制備成金標抗體檢測細菌表面抗原的分布,30年來膠體金技術得到不斷的發(fā)展和成熟,已在免疫診斷領域得到廣泛應用,顯示出了極大的魅力。目前醫(yī)學檢驗中應用的膠體金快速診斷技術主要有兩種:膠體金快速免疫層析法(colloidal gold enhanced immunochromatography assay,GICA)和快速斑點免疫金滲濾法(dot-immunogoldfiltrationassay,DIGFA)[14]。這兩種方法的基本原理都是以微孔濾膜為載體,包被已知抗原或抗體,加入待檢標本后,經濾膜的毛細管作用或滲濾作用使標本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結合,再用膠體金結物標記而達到檢測目的。

2.6 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗(latex agglutination test,LAT)是用免疫無關的載體-聚苯乙烯乳膠將可溶性JEV抗原吸附于載體顆粒表面,該載體顆粒稱為致敏顆粒。當致敏顆粒與相應抗體相遇后,在電解質的作用下抗原與抗體發(fā)生特異性結合,載體顆粒也就被動凝集起來,抗體也就以此凝集得到證明。這是一種快速簡便的實地檢測方法,但靈敏度較低。

2.7 微孔雜交法

微孔雜交法(PCR-ELISA)是使用親和素包被微孔板,再用生物素標記捕獲探針3′端,通過生物素和親和素的交聯作用將捕獲探針固定在微孔上,制成固相捕獲系統(tǒng)。在擴增時,引物用抗原(生物素、地高辛、熒光素酶等)標記,這樣擴增產物中就會帶有抗原,用擴增產物與微孔上的捕獲探針雜交,靶序列被捕獲。再在微孔中加入用辣根過氧化物酶標記的抗體,抗體與靶序列上的抗原結合,再加入底物使之顯色,從而實現對病毒的檢測。日本腦炎病毒雜交探針僅與本型病毒呈雜交陽性,而與其他各型病毒無明顯交叉。徐曉立等[15]研究證明,微孔雜交法能快速檢測出JEV。

3 分子生物學診斷方法

3.1 反轉錄-聚合酶鏈反應

反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)以待檢病毒RNA為模板,經逆轉錄生成 cDNA,再以特異性JEV引物對cDNA進行擴增。經凝膠電泳檢測,如果出現目的條帶,則該病毒為JEV。呂曉麗等[16]用該法成功檢測出JEV陽性樣本。

3.2 套式PCR

套式-PCR(RT-nested polymerase chain reaction)是應用兩對引物先后擴增靶片段的一種技術,即先應用一對外側引物進行第一次擴增,再將第一次擴增產物做為模板,用另一對內側引物對其擴增,從而保證了結果的特異性和敏感性。目前該法已成為日本腦炎的早期快速診斷有力工具。

3.3 半套式RT-PCR

半套式RT-PCR(RT-semi-nested-PCR)是應用三條引物先后擴增靶片段的一種技術,內、外套引物共用一條上游或下游的引物,在保證檢測的特異性和靈敏度的情況下,降低了引物設計的難度和成本。RT-semi-nested-PCR對腦脊液樣本檢測有明顯優(yōu)勢。

3.4 實時熒光RT-PCR

實時熒光RT-PCR是在常規(guī)PCR的基礎上加入熒光標記的核酸探針,PCR后產物無需電泳,能避免假陽性,自動分析處理數據,縮短了檢測時間,提高靈敏度和特異性。目前用于JEV檢測的實時熒光PCR主要有SYBR Green I實時PCR和Taq-ManPCR[17]。

3.4.1 SYBR Green I實時 PCR SYBR Green是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料,當它與DNA雙鏈結合時,發(fā)出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來時,熒光信號減弱。因此,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。朱兆奎等[18]研究證明,該方法可靈敏、準確檢測出JEV。

3.4.2TaqMan PCRTaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術,其核心是利用Taq酶3′→5′外切核酸酶活性,切斷探針,產生熒光信號,由于探針與模板是特異性結合,因而熒光信號的強弱就代表了模板的數量。劉衛(wèi)濱等[19]利用TaqMan PCR技術,建立了JEV實時熒光PCR檢測方法。

3.5 基因芯片技術

基因芯片(gene chip)也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray),是近年發(fā)展起來的一種新型實用的高新生物技術,已成為目前國際上生命科學研究的熱點之一[20]。基因芯片技術是利用核酸雜交原理,在基片上固定大量可尋址的靶基因構成基因芯片,芯片與熒光素標記的樣品核酸探針雜交,雜交結果經精密掃描儀掃讀和分析,該技術可用于對多種疫病的聯合檢測[21]?；蛐酒夹g具有高通量、并行性和微型化的特點,現已廣泛應用于人和動物感染性疾病的診斷[22]。張海燕等[23]成功構建了用于日本腦炎病毒與黃熱病病毒聯合診斷基因芯片。

3.6 核酸探針檢測技術

核酸探針技術是利用堿基互補原理來檢測目的同源核苷酸片段,具有敏感性高、特異性強的特點。隨著分子生物學技術的發(fā)展,核酸探針技術被廣泛地應用于各領域,如疾病診斷,特別是病毒病的診斷、基因雜交及文庫篩選等[24]。該法具有快速、準確、靈敏、操作簡單、易于大量制備等優(yōu)點,缺點是靈敏度較PCR方法低。

4 其他方法

4.1 CT檢測法

目前,CT已應用于日本腦炎診斷,黎喜等[25]通過對34例日本腦炎患者進行顱腦CT掃描,共發(fā)現異常征象者25例,陽性率為73.5%,證明該法能用于日本腦炎的診斷。

4.2 MRI診斷法

MRI診斷法(magnetic resonance imaging)在揭示丘腦和丘腦外異常表現方面比CT更敏感,丘腦改變對日本腦炎診斷有價值。Kalita J等[26]對21例日本腦炎患者頭顱進行CT掃描,有15例表現丘腦的低密度改變,31例日本腦炎病人MRI檢查均有異常改變,其中17例CT未發(fā)現異常。

5 展望

由于各種技術都有其優(yōu)點和缺陷性,為了及時、準確的對日本腦炎進行診斷,需要根據具體情況選擇合適的診斷方法。在條件允許的情況下,多種方法聯合使用,可提高診斷結果的可靠性。隨著微生物基因組學、現代分子生物學和免疫學的發(fā)展以及新儀器研發(fā)、使用,實時熒光PCR儀、基因芯片技術以及JEV單克隆抗體的廣泛應用,日本腦炎必將實現快速、準確、靈敏、特異、高通量、自動化檢測和診斷,大大提高日本腦炎診斷的準確性和效率,為挽救患者與及時的制定預防措施贏得寶貴的時間。

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Progress on Diagnosis of Japanese Encephalitis

PEI Guo-shun1,FENG Ruo-fei1,2,HOU Lan-xin1

(1.College of Li fe Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou,Gansu,730030,China;
2.Key Laboratory of State Ethnic Af fairs Commission for Bioengineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou,Gansu,730030,China)

Japanese encephalitis is an insect-borne disease harm seriously endangers the pig industry and human health,and causes large economic losses each year.In order to better control and prevention of this disease,timely diagnosis is particularly important.The diagnosis of Japanese encephalitis are virus isolation and identification,serological diagnostic technology and molecular biology technology and so on.each diagnostic technology has its advantages and disadvantages,so the appropriate method of diagnosis should be selected should be selected basing on actual situation.The paper reviewed the principles and characteristics of different diagnosis technology,and prospected the development vision diagnosisof Japanese encephalitis.

Japanese encephalitis;immunofluorescence;diagnosis;PCR;ELISA

S855.99

A

1007-5038(2010)09-0085-05

2010-03-26

裴國順(1981-),男(苗族),貴州松桃人,碩士研究生,主要從事人獸共患病診斷技術研究。