膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物源性食品中的應(yīng)用

祁光宇，智曉瑩，任維維，黃銀軍，牟克斌，劉學(xué)榮，王 宇，蔣 韜

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。它是繼三大免疫標(biāo)記技術(shù)之后又一較為成熟的、得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金技術(shù)具有方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，因而特別適合于廣大基層檢驗(yàn)人員以及大批量檢測(cè)和大面積普查等，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景，非常適用于動(dòng)物源性食品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 免疫層析快速診斷試紙條工作的基本原理

免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，也稱金溶膠。膠體金由于具有膠體穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)強(qiáng)吸附性和高電子密度等特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中[1]。免疫膠體金技術(shù)最初僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)已發(fā)展到被動(dòng)凝集試驗(yàn)、光鏡染色、免疫印跡、斑點(diǎn)金免疫滲濾法以及免疫層析技術(shù)等。目前主要有四種方法用于快速診斷技術(shù)：①雙抗夾心法：用于檢測(cè)病原微生物性的大分子抗原的檢測(cè)[2-3]；②競(jìng)爭法：用于檢測(cè)小分子抗原[4-6]；③雙抗原夾心法：用于檢測(cè)特異性的抗體[7]；④反向流動(dòng)層析法：此法可以同時(shí)檢測(cè)同種病原微生物的抗體IgG和IgM[8]。此外還有雙面試紙條法、間接法和捕獲法，后兩種方法在免疫層析試驗(yàn)中應(yīng)用較少。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、病原微生物的檢測(cè)和獸藥殘留。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物源性食品檢測(cè)中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多，在動(dòng)物源性食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用是近幾年才發(fā)展起來。國內(nèi)的研究主要集中在疾病診斷領(lǐng)域，對(duì)在動(dòng)物源性食品檢測(cè)方面應(yīng)用的研究剛剛開始。

2.1 在動(dòng)物源性食品質(zhì)量控制領(lǐng)域的應(yīng)用

對(duì)于那些不需要精確定量檢測(cè)，但需要快速得出檢測(cè)結(jié)果的成分分析，膠體金免疫層析技術(shù)尤為適用。

牛初乳IgG含量成為評(píng)價(jià)牛初乳及其制品生物活性的良好指標(biāo)。李忠秋等采用膠體金標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG作為競(jìng)爭抗原[9]，將其包被在試紙條的結(jié)合墊上，將自制的兔抗牛IgG抗體固相化在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)。通過牛乳樣品中的IgG跟膠體金標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG競(jìng)爭結(jié)合IgG抗體的結(jié)合位點(diǎn)，來反映樣品中IgG的水平。該操作所需時(shí)間短，可以進(jìn)行簡單的半定量分析，具有良好的特異性。

2.2 在動(dòng)物源性食品病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

動(dòng)物源性食品安全是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)直接造成損失，也嚴(yán)重影響個(gè)人、家庭、社會(huì)、商業(yè)及整個(gè)國家的經(jīng)濟(jì)利益。因此，為了使用安全的動(dòng)物源性食品，必須從飼養(yǎng)到餐桌全過程采取綜合措施，切實(shí)做好畜產(chǎn)品安全質(zhì)量監(jiān)測(cè)，確保生產(chǎn)安全畜產(chǎn)品。由于膠體金免疫層析技術(shù)操作簡單、檢測(cè)時(shí)間短、便于現(xiàn)場(chǎng)操作，可以為現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法帶來科學(xué)依據(jù)。

2.2.1 免疫膠體金技術(shù)在動(dòng)物源性食品病毒病診斷中的應(yīng)用

目前，一些不法商販在食品行業(yè)競(jìng)爭過程中采用不正當(dāng)手段，活體帶病動(dòng)物和食用性動(dòng)物胴體致病菌的超標(biāo)、農(nóng)藥獸藥等的殘留、違禁物質(zhì)的添加等問題層出不窮，給食品安全問題帶來了嚴(yán)重的隱患。由于金標(biāo)試紙條的診斷具有快速性和準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，也開始被逐漸應(yīng)用于畜禽病毒病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

鄭鳴等用膠體金標(biāo)記抗原和雙抗原夾心法建立的豬瘟病毒抗體檢測(cè)免疫層析試紙條，它可以用來豬瘟的臨床診斷，這種檢測(cè)方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，并且能區(qū)分強(qiáng)弱毒感染[10]；Da等用膠體金標(biāo)記AIV重組核蛋白制備試紙條，用于檢測(cè)AIV抗體，試紙條與血凝抑制（HI）試驗(yàn)相同，比瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)敏感[11]；王慧杰等用膠體金標(biāo)記PCV-2重組Cap蛋白制備膠體金快速診斷試紙，建立檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型Cap抗體的方法[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明該試紙?zhí)禺愋愿?，能夠區(qū)分PCV-2的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清。用該試紙?jiān)跈z測(cè)來自不同豬場(chǎng)的165份送檢疑似血清中與美國間接免疫熒光檢測(cè)試劑的符合率為85%以上；蔣韜等建立了口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型診斷膠體金免疫層析試劑盒，研制的口蹄疫定型試劑盒具有良好的靈敏度，可檢測(cè)到7.8×104LD50（1：128稀釋乳鼠毒）的病毒量[13]。同時(shí)對(duì)陽性及陰性樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果完全相同，具有較好的重復(fù)性。特異性試驗(yàn)證實(shí)該方法在檢測(cè)口蹄疫臨床癥狀相似病原時(shí)無交叉反應(yīng)，試劑盒對(duì)206份已知血清型田間及實(shí)驗(yàn)室樣品的符合率試驗(yàn)，O、A、AsiaⅠ型和陰性樣本的符合率分別為92.45%、91.66%、92.75%、100%，定型準(zhǔn)確率94.58%。此外，如雞新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎病、雛鵝新型病毒性腸炎等多種疫病的膠體金診斷試紙條也相繼研制出來，這給畜禽病毒病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了良好手段。

2.2.2 免疫膠體金技術(shù)在動(dòng)物源性食品細(xì)菌病診斷中的應(yīng)用

動(dòng)物性食品中常見的致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、霍亂弧菌等[14]。

杜玉萍等以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，采用膠體金免疫層析技術(shù)二步法檢測(cè)金黃色葡萄球菌，靈敏度為1×106cfu·mL-1[15]；刁琳琪等用雙抗體夾心法的原理，以膠體金標(biāo)記一株單抗制備的試紙條可快速篩選標(biāo)本中的大腸桿菌O157，試紙條檢測(cè)條靈敏度可達(dá)105cfu·mL-1，且特異性較高[16]；唐景峰等建立診斷布病的膠體金免疫層析方法體金標(biāo)記單抗，以多克隆抗體作為檢測(cè)線檢測(cè)布病，該種方法與PCR檢測(cè)符合率為100%[17]；何艷玲等研究了膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中O1群霍亂弧菌的方法[18]，該方法檢測(cè)食品中O1群霍亂弧菌的靈敏度為105cfu·mL-1，與食品中常見的致病菌無交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高，適用于食品的快速檢測(cè)。膠體金技術(shù)在動(dòng)物源性食品細(xì)菌病診斷中的作用已經(jīng)越來越突出了。

2.2.3 免疫膠體金技術(shù)在動(dòng)物源性食品寄生蟲診斷中的應(yīng)用

大多數(shù)寄生蟲病是人獸共患性疾病，因此，對(duì)畜禽寄生蟲病的早期快速診斷具有很重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。彭運(yùn)潮等利用雙抗原夾心法，以日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（(SEA）為檢測(cè)抗原研制的試紙條，與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，兩種方法具有良好的一致性[19]。秦銀霞等以膠體金標(biāo)SPA和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原制備免疫層析試紙條，試紙條對(duì)鄉(xiāng)土旋毛蟲、布氏旋毛蟲、偽旋毛蟲及納氏旋毛蟲感染動(dòng)物血清檢測(cè)的陽性率均為100%，適合于動(dòng)物旋毛蟲感染的快速血清學(xué)診斷[20]。王艷華等將抗弓形蟲抗體和弓形蟲分泌抗原用膠體金標(biāo)記后，制備檢測(cè)弓形蟲抗體的免疫膠體金快速試紙條，對(duì)已知弓形蟲陰性、陽性血清檢測(cè)，結(jié)果與IHA檢測(cè)結(jié)果的符合率為82.5%，而且敏感度高于IHA[21]。

2.3 在動(dòng)物源性食品獸藥殘留領(lǐng)域中的快速檢測(cè)應(yīng)用

現(xiàn)在獸藥殘留引起食物中毒和影響畜禽產(chǎn)品出口的報(bào)道越來越多。藥物殘留不僅可以直接對(duì)人體產(chǎn)生急慢性毒性作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，還可以通過環(huán)境和食物鏈的作用間接對(duì)人體健康造成潛在危害。近年來免疫膠體金技術(shù)在獸藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛。

陳小旋[22]用雜交瘤技術(shù)制備了3株分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并在此基礎(chǔ)上建立了克倫特羅金標(biāo)檢測(cè)試紙條。試驗(yàn)表明，該試紙最小檢出限為10 μg·kg-1，適合非專業(yè)人員在屠宰現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)鹽酸克倫特羅。王自良等以BSA-CAPHS免疫Balb/C小鼠，用細(xì)胞融合技術(shù)篩選抗氯霉素單克隆抗體（CAPmAb）雜交瘤細(xì)胞，體內(nèi)誘生腹水法制備CAPmAb，研制CAP殘留快速檢測(cè)金標(biāo)試紙（CAP-StriP），與其他酞胺醇類和抗菌素類藥物無交叉反應(yīng)，目測(cè)檢測(cè)限為0.5 μg·L-1[23]；其敏感性與競(jìng)爭ELISA試劑盒相當(dāng)符合率為100%；朱繼帥采用單克隆抗體技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)，合成并制備了鏈霉素人工抗原、抗鏈霉素單克隆抗體和膠體金，采用競(jìng)爭法建立了鏈霉素膠體金免疫層析試紙條[24]。試驗(yàn)表明，該試紙條檢測(cè)鏈霉素的靈敏度達(dá)200 ng·mL-1，對(duì)新霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、阿米卡星、恩諾沙星、氨芐青霉素、磺胺哇嗯琳的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，能基本滿足鏈霉素殘留檢測(cè)的需要。

2.4 在動(dòng)物源性食品其他殘留領(lǐng)域的快速檢測(cè)應(yīng)用

動(dòng)物源性食品中違禁藥物（如β-激動(dòng)劑、激素等）的殘留、重金屬和生物毒素含量超標(biāo)已成了困擾世界食品衛(wèi)生的難題。這些殘留不僅影響我國畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易，同時(shí)威脅著消費(fèi)者的健康。許多國家以獸藥殘留監(jiān)控為技術(shù)壁壘，阻止我國畜產(chǎn)品的正常出口。

利用免疫膠體金快速診斷來初測(cè)農(nóng)畜產(chǎn)品中的重金屬離子含量，可以節(jié)省時(shí)間，大大加快檢測(cè)進(jìn)程，提高現(xiàn)場(chǎng)抽查和快速通關(guān)檢測(cè)的效率。目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立了針對(duì)有機(jī)污染物的免疫膠體金檢測(cè)方法，并且將該方法用于重金屬離子的分析檢測(cè)，迄今為止，免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成功用于水中的銦、汞、鎘、鉛和鈾等的檢測(cè)。

在毒素檢測(cè)方面，膠體金試紙條也顯示出它的優(yōu)勢(shì)。賴衛(wèi)華等研制的膠體金試紙條用以檢測(cè)赭曲霉毒素A，檢測(cè)限為10 ng·mL-1[25]。Klewitz等利用膠體金標(biāo)記技術(shù)，分別研制了檢測(cè)A、B、D、E型肉毒毒素的試紙條，試驗(yàn)的敏感性甚至達(dá)到50 pg·mL-1[26]。

近年來，由于國家加強(qiáng)對(duì)“瘦肉精”克倫特羅的監(jiān)控，有效打擊了生豬養(yǎng)殖中非法使用“瘦肉精”的行為。但是在養(yǎng)殖業(yè)中，“瘦肉精”的替代品萊克多巴胺（Ractopamine，RCT）和沙丁胺醇卻又悄然興起。徐社會(huì)將萊克多巴胺（RAC）與BSA偶聯(lián)制成人工抗原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備了抗RAC單克隆抗體，并利用膠體金免疫層析技術(shù)，采用競(jìng)爭法研制了RAC膠體金免疫層析試紙[27]。試驗(yàn)表明，該試紙檢測(cè)靈敏度為5 ng·mL-1，在室溫干燥條件下可保存12個(gè)月以上，與克倫特羅、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反應(yīng)性都小于0.03%，試紙靈敏度、穩(wěn)定性、特異性等均達(dá)到檢測(cè)要求。

3 展望

免疫膠體金技術(shù)以其簡便快速，特異性強(qiáng)、敏感性高，肉眼判斷，試驗(yàn)結(jié)果易保存，無需特殊儀器設(shè)備和試劑等優(yōu)點(diǎn)，這些特點(diǎn)都是其他免疫學(xué)方法所無法比擬的。但膠體金免疫技術(shù)在實(shí)際研究及應(yīng)用過程中仍存在一些不足之處：首先，該方法在檢測(cè)過程中常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題[28]。其次，檢測(cè)的靈敏度及可重復(fù)性程度不高，檢測(cè)范圍需要進(jìn)一步擴(kuò)展。最后，因免疫膠體金技術(shù)是以膠體金納米顆粒作為標(biāo)記物，顆粒本身的一些特性也導(dǎo)致免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制，如在操作過程中要求清潔程度高，膠體金溶液的穩(wěn)定性較差，存放時(shí)間短，膠體金顆粒大，滲透能力較差等[29]。免疫膠體金技術(shù)應(yīng)在解決這些問題的基礎(chǔ)上向以下幾方面發(fā)展：首先，進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，拓寬檢測(cè)范圍。為放大特異性抗原抗體的反應(yīng)信號(hào)，增強(qiáng)膠體金的顯色效果，可采用生物素親和素系統(tǒng)（BAS）或免疫金銀染色法（IGSS）等措施，并結(jié)合一些相應(yīng)的生物傳感器、電化學(xué)設(shè)備來拓寬其檢測(cè)范圍[29]。Tang等基于鉑金電極修飾的膠體金提高了生物傳感器檢測(cè)HABS表面抗體的敏感性和穩(wěn)定性[30]。Kitano等用基于膠體金表面等離子共振效應(yīng)的電感受器測(cè)定胃蛋白酶的親和常數(shù)。其次，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多元化[31]。可采用多膜復(fù)合或單膜多元受體固定兩種方式，一次檢測(cè)可同時(shí)得到一組結(jié)果，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間及成本，這對(duì)于檢測(cè)某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步提高免疫金標(biāo)方法的敏感性、特異性，并實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)、定量或半定量檢測(cè)是將來該技術(shù)發(fā)展的主要方向。隨著免疫膠體金新的標(biāo)記物和制備方法的發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)將會(huì)有更為廣闊的市場(chǎng)和應(yīng)用前景。

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