重癥胰腺炎肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制及展望

劉 宏綜述,鄧明明審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川瀘州646000)

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡,是局部環(huán)境生理或病理性變化引起的、由自身內(nèi)部機(jī)制調(diào)節(jié)的一種主動的并按一定程序進(jìn)行的細(xì)胞自發(fā)性死亡方式。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)過程中血清、腹水及肝臟各種原因造成的肝損傷都可以出現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡,肝細(xì)胞凋亡是肝臟損傷的表現(xiàn)及機(jī)制之一,大量的肝細(xì)胞凋亡可造成肝功能障礙,嚴(yán)重時可發(fā)展至肝衰竭。因此,了解重癥胰腺炎時肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制將有利于重癥胰腺炎肝臟損傷的預(yù)防及治療。

1 胰腺炎時引起肝細(xì)胞凋亡因素

1.1 胰腺炎相關(guān)性腹水(pancreatitis.associated ascitic fluid,PAAF) 近年來發(fā)現(xiàn)胰腺炎相關(guān)性腹水在胰腺炎肝臟損傷肝細(xì)胞凋亡中有著重要的作用,在急性胰腺炎(acute pencreatitis,AP)時形成腹水不僅作為一種損傷體征出現(xiàn),而且具有很強(qiáng)的致病性,可以促使AP病情進(jìn)一步加劇,并造成胰外器官的損害。

Takeyama[1]通過動物實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎相關(guān)性腹水能夠?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞等器官的薄壁細(xì)胞凋亡,并導(dǎo)致急性重癥胰腺炎器官功能不全。細(xì)胞的凋亡數(shù)影響重癥胰腺炎的死亡率及發(fā)病率,控制細(xì)胞的凋亡對改善重癥胰腺炎的臨床愈后有重要的意義。Yang等[2]又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),向大鼠靜脈滴注滅菌的PAAF,同時將離體人肝細(xì)胞株(CCL-13)暴露于PAFF 24 h后,大鼠血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)水平和肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量都明顯增加。在 CCL-13中檢測到p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-m itogen-activated p rotein kinase,p38-MAPK)的激活,細(xì)胞凋亡出現(xiàn)了時間和劑量的依賴性,而caspase-3抑制劑Ⅱ可以減少凋亡。故而認(rèn)為PAAF通過p38-MAPK的激活和caspase-3依賴的途徑引起肝細(xì)胞凋亡從而造成了肝損傷。同時也有學(xué)者認(rèn)為,PAAF通過其含有的細(xì)胞毒性物質(zhì)造成了肝細(xì)胞凋亡,并發(fā)現(xiàn)PAAF導(dǎo)致肝細(xì)胞酸中毒、細(xì)胞內(nèi)鈉潴留、線粒體內(nèi)ATP耗竭等,并認(rèn)為PAAF中含有的血色素可能是造成肝臟損傷的細(xì)胞毒性物質(zhì)之一,PAAF可造成肝細(xì)胞內(nèi)鈣超載。這也可能是AP時肝臟受損以及AP造成多器官功能損傷的原因之一。

1.2 彈性蛋白酶 在正常情況下,胰液內(nèi)的胰蛋白酶原無活性,待其流入十二指腸,受到膽汁和腸液中的腸激酶(enterodinase)的激活作用后乃變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰腺炎時因某些因素激活了胰蛋白酶,后者又激活了其他酶反應(yīng),如胰蛋白酶對由脂蛋白構(gòu)成的細(xì)胞膜及線粒體膜并無作用,而胰液中的磷脂酶A被脫氧膽酸激活后,作用于細(xì)胞膜和線粒體膜的甘油磷脂,使之分解變?yōu)槊撝崧蚜字?亦稱溶血卵磷脂(lysolecithin),后者對細(xì)胞膜有強(qiáng)烈的溶解作用,可溶解、破壞胰腺細(xì)胞膜和線粒體膜的脂蛋白結(jié)構(gòu),致細(xì)胞凋亡壞死。

Sha等[3]和趙萬蓉[4]認(rèn)為胰蛋白酶是SAP多器官功能障礙的罪魁禍?zhǔn)?。彈性蛋白酶正常存在于胰腺腺泡?xì)胞的酶原顆粒和胰液中,被胰蛋白酶激活后水解彈力纖維和多種其他蛋白質(zhì).是消化破壞血管壁的關(guān)鍵酶,使血管壁水腫、出血、微循環(huán)障礙,從而造成患者早期循環(huán)紊亂,多臟器出血、血性胸腔積液及腹水。這種病理變化最明顯的是肝臟,因為肝臟是第一個接受最高濃度的胰蛋白酶靜脈血流的器官。M urr等[5]利用含胰彈性蛋白酶(1 u/m L)和/或釓(0.5 mg/m L)的灌洗液灌洗鼠的肝臟,胰彈性蛋白酶可以使流出液中AST、ALT、LDH、腫瘤壞死因子(TNF)和細(xì)胞壞死凋亡率升高,且組織中TNF-m RNA表達(dá)也增加,而釓則可以減弱彈性蛋白酶的這些作用。

由此可見,彈性蛋白酶可以導(dǎo)致類似 AP時的肝損害表現(xiàn),與彈性蛋白酶的激活可導(dǎo)致ASP時急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生是一致的,由此而認(rèn)為彈性蛋白酶是AP時全身多器官衰竭中導(dǎo)致炎癥細(xì)胞廣泛激活的重要因子。

1.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷 細(xì)胞內(nèi)Ca2+是重要的第二信使,參與細(xì)胞的多種生理功能,一旦超負(fù)荷將從多方面對細(xì)胞造成不可逆的損傷和促凋亡作用。Ueda等[6]用熒光鈣離子指示劑Fluo-2/AM檢測PAAF原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PAAF可以增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+,且在加入PAAF 1 m in后就有細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加。對PAAF成分分析發(fā)現(xiàn),只有分子質(zhì)量在5×104及其以上的成分同時具有升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+和細(xì)胞毒性的特性。且細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放阻滯劑(TMB-8)和毒胡蘿卜素都不能抑制PAAF導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高,細(xì)胞外Ca2+螯合劑EGTA則能抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高。這意味著細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加是由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)所致。血小板活化因子受體抑制劑(TCV-309)也有阻斷作用;胰腺炎相關(guān)性血清也有升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+的作用,由此認(rèn)為血小板活化因子在細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高中可能發(fā)揮著中心環(huán)節(jié)的作用。1.4 氧化劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡 氧自由基(oxygen free radical,OFR)是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物,包括超氧陰離子、羥自由基以及其與多不飽和脂肪酸作用后衍生的烷自由基、烷氧自由基、烷過氧自由基、H2O2等統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species,ROS)。正常時機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生極少,且有抗氧化防御系統(tǒng)與之對抗,不會對機(jī)體造成損傷。但在病理條件下,如缺血、缺氧、炎癥介質(zhì)釋放激活中性粒細(xì)胞(PMN)時可大量產(chǎn)生OFR,造成機(jī)體的廣泛損傷?，F(xiàn)已證實(shí),在AP時過度的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、血管活性因子,如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、血栓素A 2(TXA 2)和前列環(huán)素(PGI2)在微循環(huán)障礙中起重要作用。另外,由于炎癥介質(zhì)的作用,PMN在各種組織和器官內(nèi)聚集、活化,眾多原因均導(dǎo)致OFR以上述途徑大量釋放[7]。

已注意到細(xì)胞暴露于低水平的氧化劑中容易激發(fā)凋亡,如低濃度的過氧化氫可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,高濃度的則可誘發(fā)壞死。

由于肝臟特殊的解剖位置及功能,重癥胰腺炎時富含OFR物質(zhì)的靜脈血經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟引起肝細(xì)胞的凋亡從而引起肝細(xì)胞損傷,SAP患者幾乎很早都有肝功能異常表現(xiàn)。

1.5 線粒體功能狀態(tài)與凋亡相關(guān) 線粒體在肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,細(xì)胞受到凋亡信號刺激后,線粒體發(fā)生腫脹,位于線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔道(m itochondriumpermeability transition pore,MPTP)開放,使線粒體外膜電位降低、破裂,線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(cy tochrome C,Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apop/osis.inducing factor,A IF)、Ca2+以及活性氧等釋放到胞質(zhì)中,分別通過破壞核內(nèi)染色質(zhì)或激活caspase或作用于其他Ca2+依賴性蛋白,而引起細(xì)胞凋亡。

線粒體通過釋放出凋亡誘導(dǎo)因子和/或細(xì)胞色素C誘導(dǎo)凋亡。如線粒體內(nèi)膜發(fā)生損傷,則可導(dǎo)致線粒體功能的改變和肝細(xì)胞壞死 。另外,一系列的單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧或高氧的情況下,激活線粒體的滲透轉(zhuǎn)換能力能促進(jìn)細(xì)胞死亡[8]。

研究發(fā)現(xiàn)狗和人的PAAF均可以增加離體培養(yǎng)的鼠肝細(xì)胞線粒體呼吸的氧消耗率。并且人的PAAF增加耗氧率的作用更大,線粒體的ATP酶也被激活。進(jìn)一步研究認(rèn)為PAAF中的血紅蛋白是導(dǎo)致肝細(xì)胞損害的主要物質(zhì)之一。血紅蛋白可能是實(shí)驗中PAAF中存在的可透析性的線粒體毒性物質(zhì)之一,通過干擾線粒體呼吸功能,導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡和能量代謝失衡,參與SAP時肝細(xì)胞的損害。

2 凋亡相關(guān)基因的調(diào)控

2.1 Bax和Bcl-2 實(shí)驗發(fā)現(xiàn),SAP大鼠肝臟的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,凋亡指數(shù)增高,凋亡發(fā)生部位與病理改變明顯的部位吻合,肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)與肝功能的損害程度呈正相關(guān),說明SAP肝臟損傷至少部分是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制引起的,而且細(xì)胞凋亡是造成肝功能進(jìn)一步惡化的重要因素之一。細(xì)胞凋亡調(diào)控基因中最受關(guān)注的就是Bcb-2家族,其中Bcb-2和Pax都是Bcl-2家族成員,Bcl-2的生理功能主要是抑制細(xì)胞凋亡,延長細(xì)胞壽命。Bcl-2與Bax可形成同二聚體或異二聚體來改變線粒體的通透性,從而決定細(xì)胞的生存與死亡。當(dāng)Bcl-2相對量高于Bax時,Bcl-2同二聚體增多并促進(jìn)形成Bcl-2-Bax異二聚體,而Bcl-2同二聚體和Bcl-2-Bax異二聚體都可抑制細(xì)胞凋亡;相反當(dāng)Bax的量相對高于Bc1-2時,則Bax同二聚體增多,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。因而Bcl-2/Bax兩蛋白的比例是決定細(xì)胞凋亡或存活的關(guān)鍵因素[10]。除此以外,Bcl-2還可以通過直接或間接的影響細(xì)胞信號傳遞蛋白,如抑制WTp53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。而應(yīng)用DDFA(D:地塞米松,D;低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A;抑肽酶)治療后,Bax基因表達(dá)明顯下調(diào),而Bel-2基因表達(dá)明顯上調(diào),Bel-2/Bax比值上升。SAP時隨著肝臟凋亡細(xì)胞數(shù)增多、Bax基因表達(dá)明顯上升,Bel-2的表達(dá)下調(diào),肝功能進(jìn)一步惡化,DDFA使Bax基因表達(dá)明顯下調(diào),而Bel-2基因表達(dá)明顯上調(diào),減少肝臟細(xì)胞凋亡可明顯改善肝功能。因此認(rèn)為,DDFA對肝功能的保護(hù)作用可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2從而影響細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[12]。

2.2 轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1) TGF-β1是一種廣泛存在的生長抑制因子,可抑制肝細(xì)胞、胃腸道上皮細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn),在肝臟、枯否細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、貯脂細(xì)胞和竇周細(xì)胞均表達(dá)TGF-β1。雖然正常肝臟細(xì)胞或剛分離的新鮮肝細(xì)胞不表達(dá) TGF-β1的m RNA或蛋白,但培養(yǎng)后的肝細(xì)胞和肝細(xì)胞瘤中的細(xì)胞可獲得表達(dá)TGF-β1的能力,另外肝臟處于其他疾病時也可檢測到有TGF-β1生成,而且和肝細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。Kusaka等[13]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1的含量與肝細(xì)胞的凋亡數(shù)成正比。Nakamura等[14]發(fā)現(xiàn),大鼠AP時TGF-β1在血漿、PAAF、肝組織和腹膜巨噬細(xì)胞中的水平都升高,其中和抗體可以減少肝細(xì)胞的凋亡,降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶,而巨噬細(xì)胞的清除明顯降低了血漿和PAAF中TGF-β1蛋白的水平,且明顯抑制了肝組織中 TGF-β1的激活。因此認(rèn)為,AP肝損傷與巨噬細(xì)胞引起的凋亡有關(guān),而其衍生的TGF-β1是誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的重要因子。有研究同時發(fā)現(xiàn)急性出血壞死性胰腺炎(ANP)時PAAF、血漿和肝組織中有較高的TGF-β1濃度,用TGF-β1抗體中和技術(shù)可以減少肝細(xì)胞的凋亡。可見PAAF中的 TGF-β1由腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,也可經(jīng)腹膜吸收入血,從而介導(dǎo)遠(yuǎn)隔臟器細(xì)胞的凋亡。

2.3 Kup ffer細(xì)胞與Fas/FasL基因 研究發(fā)現(xiàn),AP時Kupffer細(xì)胞衍生的 Fas配體(FasL1、p38-M APK)、caspase-3表達(dá)增加,并且誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡損傷[15-16]。Gallagher等[17]又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),在Fas/FasL基因敲除大鼠中,AP誘導(dǎo)的p38-MAPK表達(dá)顯著降低,肝細(xì)胞的凋亡也明顯減少。推測Fas/FasL在AP肝細(xì)胞的凋亡中起關(guān)鍵作用。Peng等[18]通過膽堿缺乏和乙硫氨酸補(bǔ)充飲食(CDE)誘導(dǎo)大鼠AP模型,并用胰彈性蛋白酶在p65 siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠離體Kup ffer細(xì)胞株中模擬AP損傷模型,實(shí)驗發(fā)現(xiàn)CDE胰腺炎引起p65 NF-kappa B/RelA核轉(zhuǎn)位、Fas/FasL和caspase-3表達(dá)增加以及大鼠肝細(xì)胞核內(nèi)DNA斷裂。而在體外實(shí)驗中,p65-siRNA的轉(zhuǎn)染減弱了彈性蛋白酶誘導(dǎo)的p65 NF-kappa B/RelA核轉(zhuǎn)位和Kupfer細(xì)胞的凋亡,證明 AP通過 NF-kappa B途徑誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞凋亡,并認(rèn)為 Kup ffer細(xì)胞衍生的Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和NF-kappa B途徑誘導(dǎo)的Kup ffer細(xì)胞凋亡之間的平衡失調(diào)程度決定了AP時肝臟損傷的程度。

3 阻斷肝細(xì)胞過度凋亡在重癥胰腺炎肝損傷中的應(yīng)用前景

肝細(xì)胞凋亡在重癥胰腺炎肝臟損傷中發(fā)揮著重要的作用。重癥胰腺炎時機(jī)體通過多種途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡,其中以PAAF的毒性作用及氧自由基損傷和缺血損傷占有重要的作用。大量實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn),重癥胰腺炎時肝臟的損傷情況與肝細(xì)胞的凋亡呈正相關(guān),且組織損傷與病理改變相符合。對于肝細(xì)胞凋亡在重癥胰腺炎時肝臟損傷中作用的認(rèn)識,促使人們探討新的阻止肝細(xì)胞死亡的方法來治療及預(yù)防重癥胰腺炎對肝臟的損傷。有研究發(fā)現(xiàn),對重癥肝炎的小鼠注射抑制caspase蛋白酶核心的三肽,可以阻止肝細(xì)胞凋亡和肝功能衰竭的發(fā)生,使小鼠的肝臟功能改善。熊去氧膽酸可通過結(jié)合并排出有毒的膽鹽阻止凋亡,這種膽鹽存在于鼠的肝細(xì)胞線粒體中,可以阻止線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換,保護(hù)線粒體功能。

如何阻止肝細(xì)胞的過度凋亡,將成為治療重癥胰腺炎肝臟損傷及肝病研究領(lǐng)域的新的熱點(diǎn),也將為胰腺炎肝臟損傷的治療帶來新的方法。

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