乳及乳制品中朊蛋白及其安全性研究進(jìn)展

管 峰 石國(guó)慶 趙 進(jìn) 楊利國(guó)

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832000; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室,武漢 430070）

朊蛋白（p rion proteins,PrP）是近年來(lái)確認(rèn)的引起人畜共患病的一種蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)具有自我復(fù)制和傳播能力,尤其在英國(guó)“瘋牛病”事件以后,對(duì)PrP的研究受到世界各國(guó)的重視。PrP空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是可傳播性海綿狀腦?。╰ransmissible spongiform encephalopathie,TSE）的根源,該病導(dǎo)致患病動(dòng)物大腦中大量神經(jīng)細(xì)胞死亡并出現(xiàn)海綿狀空泡化且具有一定傳染性。反芻動(dòng)物乳及加工后的乳制品中存在PrP,因此其潛在威脅備受人們的重視并對(duì)此開(kāi)展了許多研究。

本文從PrP的基本特征、生理功能、乳及乳制品中PrP的來(lái)源和含量以及安全性評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行簡(jiǎn)述,以便為乳品安全和乳用動(dòng)物的育種研究提供理論參考。

1 PrP特征及相關(guān)疾病

PrP是一類(lèi)小分子疏水性糖蛋白,在理化性質(zhì)上與普通蛋白質(zhì)存在較大差別。PrP對(duì)化學(xué)試劑與生化試劑等表現(xiàn)出強(qiáng)抗性,對(duì)諸多物理因素如80～100℃高溫均有相當(dāng)?shù)哪褪苣芰1]。PrP是由動(dòng)物單一PrP基因（prion p ro tein gene,PRNP）編碼的大小約250個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá),在非神經(jīng)系統(tǒng)少量或微量表達(dá),且在不同物種中高度保守,DNA和氨基酸序列的相似性分別達(dá)到90%和95%以上[2]。人類(lèi)和小鼠的PRNP分別定位于20號(hào)和2號(hào)染色體[3],綿羊和牛PRNP均定位于13號(hào)染色體[4-5]。

細(xì)胞PrP（PrPC）因空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為致病PrP （PrPSc）而導(dǎo)致PrP疾病,但這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞PrP對(duì)生物體的生理作用尚不完全清楚,推測(cè)在神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)與功能維持、保護(hù)活性氧誘導(dǎo)的DNA損傷、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Cu2+、Ca2+代謝等方面具有重要功能[6-7]。有研究認(rèn)為,TSE發(fā)病是因?yàn)榧?xì)胞PrP正常神經(jīng)保護(hù)作用喪失,大腦中細(xì)胞PrP嚴(yán)重減少所致[8]。研究證明,在PRNP敲除小鼠大腦部位蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著升高,加上此時(shí)缺乏抗氧化酶的大腦環(huán)境還要承受較強(qiáng)的氧化作用（吸入氧的20%）,因此易于發(fā)生氧化損傷;反之證明,抗氧化能力強(qiáng)的細(xì)胞系都具有較高的細(xì)胞PrP表達(dá)水平,高表達(dá)的細(xì)胞PrP可以修復(fù)氧化應(yīng)激造成的DNA損傷,減少神經(jīng)變性疾病發(fā)生[9-10]。

PrP疾病是一類(lèi)神經(jīng)退行性疾病的總稱(chēng),主要包括羊的癢?。╯crapie）、牛海綿狀腦?。˙SE,即“瘋牛病”）、人庫(kù)魯氏?。↘uru）、克雅氏病（CJD）、格斯特曼綜合癥（GSS）、家族致死性失眠綜合癥（FFI）和新型克雅氏?。╲CJD）等。流行病學(xué)研究認(rèn)為,TSE的傳播與來(lái)自感染的動(dòng)物源性物質(zhì)尤其與BSE感染的肉骨粉等材料有關(guān),也是人類(lèi)新型克雅氏病的潛在致病源[11]。

2 乳及乳制品中PrP的含量

乳及乳制品是人類(lèi)攝入蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一,與人類(lèi)的生活關(guān)系極為密切。乳及乳制品中PrP的安全性直接關(guān)系到人類(lèi)的健康,甚至生命安全。因此,對(duì)乳及乳制品中PrP的檢測(cè)也就隨之成為人們研究的熱點(diǎn)。鑒于PrP在血液組織中的存在,推測(cè)可能在乳中存在來(lái)自血細(xì)胞或者乳腺上皮細(xì)胞的PrP。但是,由于技術(shù)的限制,乳中高含量的總蛋白（約40mg/L）和大量脂類(lèi)物質(zhì)（約35mg/L）的存在限制了原有的生化方法對(duì)PrP進(jìn)行有效的檢測(cè),只能在血細(xì)胞成分中檢測(cè)到細(xì)胞PrP和病變PrP的存在,直到2006年尚不能對(duì)乳中PrP進(jìn)行定性檢測(cè)[12]。

隨著蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用免疫組化、免疫沉淀、蛋白質(zhì)雜交和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附）等綜合方法,證明在反芻動(dòng)物乳和乳腺細(xì)胞中PrP的表達(dá)具有種類(lèi)特異性,其含量在牛、綿羊和山羊的乳腺、脫脂乳、乳清蛋白以及乳酪中存在差異,PrP相對(duì)含量最高的是乳酪,且乳中PrP具有和近似神經(jīng)組織中PrP全長(zhǎng)的序列和結(jié)構(gòu)特征[13-14]。對(duì)山羊乳的研究證明,乳中PrP相對(duì)神經(jīng)組織PrP電泳遷移率增加[14]。蛋白質(zhì)雜交研究表明,山羊和綿羊乳中所有PrP均含有分子量12 ku的組分,且這一分子量縮短的PrP在山羊乳清蛋白中是優(yōu)勢(shì)蛋白質(zhì)[13]。

Franscini等[12]通過(guò)一種特異性吸附劑結(jié)合并濃縮細(xì)胞PrP和病變PrP的方法,分別對(duì)10m L牛乳、綿羊乳、山羊乳和人乳中的PrP進(jìn)行雜交檢測(cè),在牛乳中檢測(cè)到3個(gè)亞型,分子量分別為34、30和27 ku,并分別對(duì)應(yīng)雙糖基化、單糖基化和非糖基化PrP。最小的非糖基化PrP的分子量高于重組牛PrP分子量（26 ku）,這是因?yàn)樘烊籔rP帶有一個(gè)糖基化磷脂?；煎^定位點(diǎn)。綿羊乳、山羊乳和人乳中PrP總量差異很大,但基本分子量分布和牛乳相似。對(duì)乳中PrP定量研究表明,PrP在鮮牛乳中的總含量為200 pg/m L,鮮綿羊乳和山羊乳中PrP含量分別約為1 ng/m L和40 pg/m L,人乳中則少于10 pg/m L。PrP在綿羊乳、牛乳、山羊乳和人乳中的含量比約為100∶20∶4∶1。在經(jīng)過(guò)巴氏消毒和超高溫消毒加工后的牛乳中仍能很清楚的檢測(cè)到PrP的存在,含量和山羊乳相當(dāng),而綿羊乳在稀釋4倍后含量仍為山羊乳的10多倍[12]。

3 乳及乳制品中PrP的來(lái)源

一般來(lái)說(shuō),健康乳用動(dòng)物如奶牛所產(chǎn)的正常乳中都含有一定數(shù)量的體細(xì)胞,但是一般均低于2× 105個(gè)/m L,這是動(dòng)物乳腺自身免疫的需要[15]。這些細(xì)胞多是來(lái)自白細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞（約占98%）,其他則來(lái)自于乳腺組織脫落的上皮細(xì)胞[12,16]。當(dāng)動(dòng)物受到外界或自身因素影響,乳腺感染后由于白細(xì)胞的吞噬作用會(huì)引起乳中細(xì)胞數(shù)量增加。一般來(lái)說(shuō),乳中PrP的來(lái)源有以下幾種途徑:乳腺上皮細(xì)胞的胞外分泌;乳球蛋白的分泌;血清和間質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)的跨膜作用和血漿成分以及粒細(xì)胞的分泌作用[14]。最新研究顯示牛乳腺細(xì)胞中PrP在乳腺上皮細(xì)胞選擇定位,主要分布于分泌活性較高的基底細(xì)胞表面[17]。乳腺細(xì)胞中乳球蛋白的分泌模式是PrP進(jìn)入乳中的主要途徑[12]。

由于PrP特殊的物理和化學(xué)性質(zhì),乳制品的加工一般不會(huì)影響乳中PrP的結(jié)構(gòu),但多數(shù)因?yàn)橄♂尪购拷档汀Ｊ惺鄣娜?、半脫脂乳和脫脂乳均有PrP存在,但含量比鮮乳有所下降,兒童配方奶粉中PrP含量很低甚至在目前的檢測(cè)限度以下[14]。

4 乳及乳制品中PrP的安全性

有關(guān)乳及乳制品的安全性研究始于20世紀(jì)60年代,多年來(lái)由于一直未能在染病動(dòng)物乳中找到傳播因子的存在,研究人員因此認(rèn)為乳及乳制品都是安全的[18]。在早期研究中,Vetrugno等[19]用“瘋牛病”奶牛所產(chǎn)的乳以口服（每只每天30m L）、腦內(nèi)注射（每只每天0.02 m L）或者腹腔注射（每只每天0.10 m L）方式給小鼠,經(jīng)過(guò)2年的觀察未發(fā)現(xiàn)任何臨床癥狀和神經(jīng)損傷,通過(guò)飼喂小鼠含有病變PrP的牛乳,也未發(fā)現(xiàn)牛乳傳播的證據(jù)[14]。另外,在人類(lèi)飲用牛乳的跟蹤調(diào)查中也沒(méi)有觀察到感染人的現(xiàn)象,因此認(rèn)為牛乳以及相關(guān)乳制品不具有感染性[20]。此外,世界上所有權(quán)威機(jī)構(gòu)都投入精力對(duì)此進(jìn)行了研究,包括世界衛(wèi)生組織、國(guó)際獸醫(yī)組織、歐盟委員會(huì)、英國(guó)海綿狀腦病咨詢委員會(huì)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部,研究人員也一致認(rèn)為牛乳是安全的,美國(guó)甚至沒(méi)有禁止從“瘋牛病”疫區(qū)進(jìn)口乳制品[21]。與此相反的是,羊瘙癢病卻廣泛傳播,在這種情況下研究人員又不得不懷疑同時(shí)患有乳腺炎的患病羊的乳是否會(huì)造成污染[22]。這一時(shí)期,“瘋牛病”傳播并導(dǎo)致人類(lèi)感染新型克雅氏病的證據(jù)伴隨著乳中PrP的發(fā)現(xiàn)再次向人們敲響了乳及乳制品安全性的警鐘[23-24]。

最近的幾年里,生物檢測(cè)新技術(shù)在PrP的安全性檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用,在取得重要突破的同時(shí)也成為生物安全領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。近期研究發(fā)現(xiàn),PrP可以在患癢病綿羊的乳腺中自我復(fù)制,這就意味著羊乳有可能是TSE的傳染源,后來(lái)的試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。Konold等[25]對(duì)18只癢病易感基因型羔羊口服患病綿羊的乳,在死亡的羔羊回腸組織中發(fā)現(xiàn)了病變PrP,但沒(méi)有臨床表現(xiàn);7個(gè)月后試驗(yàn)組15只羔羊檢測(cè)病變PrP全部呈陽(yáng)性,對(duì)照組14只羔羊?yàn)殛幮?但2組羔羊混合飼養(yǎng)后對(duì)照組中部分羔羊發(fā)病。這一研究不但證明癢病可以由乳傳播,而且可以在羊群中水平和垂直傳播。

類(lèi)似的研究證明,食用患病或隱性感染山羊的初乳和常乳可以使小鼠感染羊的癢病,但感染小鼠的乳不具有二次傳染力[12]。由此研究者認(rèn)為不但動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞PrP可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏rP,而且體內(nèi)進(jìn)入乳中的PrP也會(huì)發(fā)生這種空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[12],至此全面肯定了患TSE病動(dòng)物的乳及乳制品不但是PrP的重要來(lái)源而且能傳播此病。在乳及乳制品的感染成分中,尤其以細(xì)胞碎片、酪蛋白乳清和乳酪的感染力較強(qiáng),而初乳和常乳的感染滴度都比較低[18]。值得關(guān)注的是,種間傳播屏障的存在會(huì)降低乳的傳播風(fēng)險(xiǎn)[18]。在傳播方式上,人工喂養(yǎng)比哺乳方式感染癢病的風(fēng)險(xiǎn)要低[26]。

5 結(jié) 語(yǔ)

據(jù)統(tǒng)計(jì),世界乳品年產(chǎn)量約5億t,占人類(lèi)攝入蛋白質(zhì)的13%。這些乳品大多是均質(zhì)化處理并采取巴氏消毒或者超高溫滅菌,但這并不能破壞其中的朊蛋白。如果患有乳房炎等疾病的動(dòng)物血-乳屏障遭到破壞,則乳中PrP含量增加,此時(shí)病變PrP積聚在乳腺管淋巴細(xì)胞中并能自我復(fù)制,從而殘留在乳中,大大增加了乳的安全隱患[22]。盡管如此,人類(lèi)還是在不斷探索中通過(guò)檢疫等有效手段預(yù)防了類(lèi)似“瘋牛病”的傳播。但同時(shí),乳中PrP的安全性也不容忽視,對(duì)乳和乳制品及其安全性的研究使我們?cè)谌槠钒踩矫媸艿絾⑹?一方面,在加工過(guò)程中可以用現(xiàn)代生物技術(shù)檢測(cè)、調(diào)控或分離乳中的細(xì)胞甚至低豐度的特定蛋白質(zhì)[27-28];另一方面,在加強(qiáng)動(dòng)物檢疫的同時(shí)可以選育牛羊等乳用動(dòng)物的抗病能力[7,29],從源頭上為人類(lèi)提供更安全的乳。

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Au thor,GUAN Feng,associate professor,E-mail:jlguanfeng@yahoo.com.cn

（編輯 菅景穎）