微囊藻毒素完全抗原的研制

張 愛,孫長青,周 圓,鐵 程,金 玉,楊 良

(1.云南大學(xué),云南昆明650091;2.昆明理工大學(xué),云南昆明650091;3.云南省環(huán)境監(jiān)測中心站,云南昆明650034)

微囊藻毒素完全抗原的研制

張 愛1,孫長青1,周 圓2,鐵 程3,金 玉3,楊 良3

(1.云南大學(xué),云南昆明650091;2.昆明理工大學(xué),云南昆明650091;3.云南省環(huán)境監(jiān)測中心站,云南昆明650034)

為研制通用性微囊藻毒素(Microcystins,MCs)完全抗原,首先選用硫醇鹽將微囊藻毒素氨基衍生化,利用戊二醛兩步法合成完全抗原,戊二醛的兩個醛基分別與微囊藻毒素和牛血清白蛋白上的氨基發(fā)生反應(yīng),形成穩(wěn)定的Schiff堿,從而達(dá)到微囊藻毒素的完全抗原化。結(jié)果顯示,偶聯(lián)比在3～18∶1,平均偶聯(lián)比為8∶1,可作為下一步免疫的完全抗原使用。

微囊藻毒素;戊二醛兩步法;完全抗原

微囊藻毒素(MCs)種類繁多,目前所發(fā)現(xiàn)的微囊藻毒素異構(gòu)體有60多種。但它們有共同的特點(diǎn),如圖1所示[1,2]:環(huán)狀七肽(D-丙氨酸-LX-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸),變化主要在于第2位X、第4位Y氨基酸的不同,第5位氨基酸Adda(3-氨基9-甲氨基2,6,8-三甲基10-苯基4,6-二烯酸)是微囊藻毒素生物活性表達(dá)所必須的。其中MC-LR型最為常見,毒性最強(qiáng)急性危害最大。本文以MC-LR的酶聯(lián)免疫法測試盒研制為最終目標(biāo),對MC-LR完全抗原的制備研究展開討論。

1 材料與方法

1.1 材料

微囊藻毒素-LR(自制)、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、NaOH、高純氮、冰醋酸、乙腈、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、甲醇均為分析純,三氟乙酸(TFA,Jtbaker)、500mgWaters Sep2 Pak C18cartridge、氮吹儀、2-巰基乙胺、戊二醛均為Sigma、牛血清白蛋白(BSA,Solarbio)、透析袋(M=8000-15000,鼎國)。

1.2 方法

利用乙胺硫醇鹽巰基的較強(qiáng)親核加成反應(yīng)特點(diǎn),在微囊藻毒素的第7位氨基酸不飽和雙鍵位置(圖1右上角圓圈所示)發(fā)生Michael加成反應(yīng)而使微囊藻毒素活化,從而鏈接上可用于蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的活性基團(tuán)游離氨基[3～6];然后采用戊二醛兩步法通過醛基與伯氨基之間形成Schiff堿,將已活化的微囊藻毒素和牛血清白蛋白耦聯(lián)(見圖2)起來[5,7]。

2 具體操作過程

2.1 微囊藻毒素的氨基化

(1)把MC-LR按1～5mg/ml溶于乙醇中,取1體積MC-LR溶液與1.5體積的去離子水、2體積的二甲基亞砜(DMSO)、0.67體積5mol/L的NaOH以及1g/ml溶于去離子水的2-巰基乙胺體系混合,置于氮吹儀50℃下孵育30min。

(2)反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫,加入與體系等體積的冰醋酸終止反應(yīng),并用0.1%的三氟乙酸溶液稀釋至5倍,用三氟乙酸調(diào)節(jié)pH至1.5。

(3)上樣過500mgWaters Sep-Pak C18柱純化產(chǎn)物,柱子先用一管乙腈活化,再用一管去離子水調(diào)節(jié)活化,過完柱先用含0.1%三氟乙酸的10%乙腈溶液洗脫雜質(zhì),待萃取柱吹干后用含0.1%三氟乙酸的乙腈洗脫微囊藻毒素并收集。

2.2 戊二醛兩步法合成微囊藻毒素完全抗原

(1)按3mg/ml溶解于H2N-e tMC-LR與0.01mol/L PBS里,加入等體積的10%戊二醛PBS溶液,室溫振蕩反應(yīng)4h以上。

(2)反應(yīng)結(jié)束上樣過500mg Waters Sep-Pak C18柱純化所得產(chǎn)物(用甲醇活化、洗脫)。

(3)用氮吹儀吹干甲醇并溶解于3ml 0.01mol/L的PBS里,按MC-LR∶BSA為10∶1加入1mg/mlBSA溶液,振蕩反應(yīng)4h以上。

(4)反應(yīng)結(jié)束,將混合液轉(zhuǎn)移至透析袋中于0.01mol/L PBS中振蕩透析24h,并每隔8h更換PBS溶液。

3 產(chǎn)物的鑒定及結(jié)果

3.1 H2N-e tMC-LR的鑒定及結(jié)果

用質(zhì)譜儀直接測量分子量范圍。本實(shí)驗(yàn)采用的是EI離子源,MC-LR的相對分子量為995.2D,2-巰基乙胺的相對分子量為77D,故目標(biāo)產(chǎn)物的分子量應(yīng)是1072.2D。由圖3可看出相應(yīng)的質(zhì)荷比為1073的峰,以及很強(qiáng)的雙電荷峰537,所以理論值與實(shí)際值是一致的,表明這一步的氨基修飾是成功的。

3.2 微囊藻毒素完全抗原的鑒定

3.2.1 定性分析

運(yùn)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)對合成物做定性分析。如圖4所示,向上、向下箭頭所指分別代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白中牛血清白蛋白以及測試樣品中目標(biāo)物(MC-LR-BSA)的電泳情況。目標(biāo)物(MC-LR-BSA)的條帶明顯寬于標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶,說明目標(biāo)物的平均分子量范圍都大于牛血清白蛋白,這說明微囊藻毒素與牛血清白蛋白的耦聯(lián)是成功的。

3.2.2 定量分析

采用生物質(zhì)譜技術(shù)對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析,本試驗(yàn)所合成的完全抗原經(jīng)透析純化和脫鹽處理后經(jīng)MALD I-TOF-MS檢測,得到如圖5所示的質(zhì)譜圖。

由質(zhì)譜圖可知,75307.7是偶聯(lián)物的最大信號所對應(yīng)的分子量值,牛血清白蛋白的分子量范圍在67000左右,合成的H2N-e tMC-LR的分子量為1072.2,因此可以看成在牛血清白蛋白上每連接上一個H2N-e tMC-LR,分子量增加1000。從圖5可看出合成MC-LR-BSA的分子量范圍在70000～85000,也即偶聯(lián)比MC∶BSA=(3～18)∶1,而平均偶聯(lián)比為MC∶BSA=8∶1。由此進(jìn)一步說明微囊藻毒素與牛血清白蛋白的耦聯(lián)是成功的,可以作為下一步動物免疫的完全抗原使用。

4 討論和展望

(1)在微囊藻毒素的氨基衍生化反應(yīng)過程中存在不同的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象:反應(yīng)的最終混合溶液的顏色有兩種,一種是淺紫色,一種是淡黃色。后經(jīng)質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示有同樣的質(zhì)譜圖,且對往后合成的完全抗原也沒有影響。筆者猜測,可能是異構(gòu)體,這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

(2)戊二醛兩步法過程中反應(yīng)時間是關(guān)鍵,反應(yīng)時間為1h時只有很少的藻毒素聯(lián)接上,反應(yīng)時間為4h時達(dá)到最高。具體的反應(yīng)時間與結(jié)合率的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

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Advance of MicrocystinsπComplete Antigen

ZHANG Ai1,SUN Chang2qing1,ZHOU Yuan2,TIE Cheng3,JIN Yu3,YANG Liang3
(1.Yunnan Nniversity,Kunming Yunnan 650091 China)

Mercaptide is used to make MCs into derivatization of amino firstly,then the immunogenicity antigen is synthesized with Glutaraldehyde two-step method.Both of aldehide groups of Glutaraldehyde react with amino of Bovine Serum Albumin(BSA)ofMCs respectively and produce a stable Schiff base,in the end,the complete anti2 gen of MCs is synthesized theoretically.The results show that the coupling rate between MCs and BSA is 3 and 18 to 1,and the average coupling rate is 8 to 1.The complete antigen ofMCs can be used in immunity sufficiently.

microcystins(MCs);Glutataldehyde two-step method;complete antigen

X17

A

1673-9655(2010)03-0001-03

2010-03-10