慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴細(xì)胞變化與其HBV-DNA的水平相關(guān)性探討

鄭源海，周艷貞，林元峰，周藝華

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 漳州363000)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種非細(xì)胞毒性病毒，其所致的肝細(xì)胞損壞是由機(jī)體針對(duì)HBV特異性抗原的免疫反應(yīng)所引起，HBV感染所致的不同臨床結(jié)果與機(jī)體不同的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[1]。機(jī)體免疫功能及病毒逃逸免疫的能力決定了HBV感染發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[2]。本文采用直接免疫熒光法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B 淋巴細(xì)胞 (CD19+)及采用FQ-PCR檢測(cè)血清中HBV-DNA載量水平，來(lái)評(píng)價(jià)HBV感染后血清HBV-DNA水平與機(jī)體免疫功能變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 91例慢性乙肝病毒(HBV)感染者，男64例，女27例，年齡 17～75歲，平均年齡36.9歲，符合2000第十次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組31例，其中男21例，女10例，年齡22～70歲。平均年齡35.7歲，均為我院體檢中心體檢合格的健康人。

1.2 儀器和試劑 IMMUNO-TROLTMCells標(biāo)準(zhǔn)品、CD19-PE、 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標(biāo)記抗體及紅細(xì)胞裂解液 (Opti Lyse○RC)購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司，流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL型流式細(xì)胞儀，HBV核酸熒光定量PCR試劑盒為廈門(mén)安普利生物工程有限公司生產(chǎn)，PCR擴(kuò)增儀為Amplly公司的GeneLight9800熒光定量核酸擴(kuò)增儀。

1.3 標(biāo)本收集 抽取靜脈血6ml分三管，一管用EDTA-K2抗凝，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；另兩管為分離膠管，分離血清后用于HBV及HBV-DNA病毒檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)方法 采用IMMUNO-TROLTMCells標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。各取100μl抗凝血于流式專用試管中，分 別 加 入 20μl CD19-PE、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標(biāo)記抗體，室溫閉光反應(yīng)20min，加入500μl紅細(xì)胞裂解液，溶解紅細(xì)胞15min，加入500μl鞘液混勻，1000rpm/min 離心 5min，棄上清，再加入500μl鞘液，混勻后上機(jī)檢測(cè)并記錄熒光抗體染色陽(yáng)性 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及 CD19+百分率。HBV-DNA定量分析采用熒光定量PCR法，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，HBV-DNA檢測(cè)單位IU/ml表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P＜0.05為明顯差異，P＜0.01為顯著差異。

2 結(jié)果 見(jiàn)表1。

3 討論

CD3分子構(gòu)成TCR/CD3復(fù)合體為T(mén)細(xì)胞的特異性表面分子。根據(jù)T細(xì)胞表面表達(dá)CD4+CD8+分子，又分為T(mén)輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群(CD3+CD4+)和T抑制細(xì)胞亞群(CD3+CD8+)。TH細(xì)胞可產(chǎn)生多種淋巴因子，在體液免疫和細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，在病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮中心作用；同時(shí)，對(duì)病毒清除起重要作用[3]。CD8+T細(xì)胞激活和抑制嚴(yán)格依賴CD4+TH細(xì)胞，正常情況下，兩者保持一定的比例，維持機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。TCR/CD3復(fù)合體是CD3+T細(xì)胞與T細(xì)胞抗原受體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)(TI)結(jié)合形成的，傳遞信息。所以T淋巴細(xì)胞狀態(tài)直接反映細(xì)胞免疫狀況。本文結(jié)果表明DNA低拷貝組、高拷貝組的CD3+T細(xì)胞百分率及CD3+CD4+T與對(duì)照組、DNA陰性組比較明顯減低，表明感染者特異性T細(xì)胞作用有所加強(qiáng)，而T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群(CD3+CD4+)細(xì)胞生成減少，使特異性抗體產(chǎn)生不足，不能清除游離的乙肝病毒,可造成病毒在體內(nèi)持續(xù)存在。CD4+/CD8+比值可監(jiān)測(cè)人體細(xì)胞免疫功能，反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，比值失衡可能造成免疫紊亂和一系列免疫病理改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組、DNA陰性組比較，低拷貝組、高拷貝組CD4+/CD8+比值顯著差異 (P＜0.01)，與相關(guān)報(bào)道一致[4-5]。 動(dòng)態(tài)觀察該比值的變化趨勢(shì)可以反映HBV-DNA體內(nèi)復(fù)制情況。

表1 HBV感染者外周血T、B淋巴細(xì)胞與HBV-DNA載量水平分析

人體體液免疫是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成成分之一，在人體特異免疫功能中起著重要的作用，是致敏B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，即轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體[6]。B淋巴細(xì)胞作為人體的主要體液免疫細(xì)胞，其細(xì)胞表面標(biāo)志已被人們所認(rèn)識(shí)，CD19+細(xì)胞代表B淋巴細(xì)胞水平。乙型肝炎病毒并不直接引起肝細(xì)胞的損傷，而是由于感染乙型肝炎病毒后引起人體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝病毒(HBV)感染者的各組CD19+明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。說(shuō)明體液免疫在慢性肝炎的病程中起到關(guān)鍵作用，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體能對(duì)血液中的乙型肝炎病毒進(jìn)行反應(yīng)加以殺滅。

綜上所述，通過(guò)對(duì)HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及B淋巴細(xì)胞檢測(cè)，可及時(shí)提示HBV感染者免疫功能的變化并加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)。

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