時(shí)間依賴(lài)性熒光衰減對(duì)HLA-B27檢測(cè)結(jié)果的影響

左 芳 ，程 暉 ，饒錦秀，翟中良，汪宏良

(1、湖北省黃石市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，湖北 黃石 435000；2、黃石理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 435000)

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的對(duì)單細(xì)胞定量分析的一種新技術(shù)，通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中排成單列的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐個(gè)分析、測(cè)定細(xì)胞或顆粒的光散射和熒光情況，獲取其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA等理化特性。它借鑒了熒光技術(shù)、激光技術(shù)，單抗技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)等多門(mén)學(xué)科和技術(shù)，有檢驗(yàn)速度快、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大、對(duì)所需的細(xì)胞或顆粒可以進(jìn)行分選等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐等各個(gè)方面[1]。批量標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)本的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生一定的變化，我們對(duì)HLA-B27檢測(cè)中熒光衰減與實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的關(guān)系作了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 按照1984年紐約修訂的AS(Ankylosing spondylits，AS)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，選擇 2008 年6月～2010年6月本院門(mén)診及住院AS患者56例，其中男性41例，女性15例，年齡18～41歲，平均年齡29.6歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 EPICS-XL流式細(xì)胞儀由美國(guó)貝曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)，標(biāo)記物(HLA-B27-FITC/HLA-R7-PE)、陰性對(duì)照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)、溶血?jiǎng)?(Optilyse)、鞘液(Cell Sheath)、清洗液均由美國(guó)貝克曼公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 患者早晨空腹采取靜脈血，EDTA-K2抗凝，混勻后待檢。抗凝血100μl加入HLAB27-FITC/HLA-B7-PE 10μl后混勻，室溫避光放置15min后加溶血?jiǎng)?00μl，室溫避光放置20min。加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清液，混勻后再加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清，混勻加鞘液500μl，上機(jī)測(cè)定，每份樣本檢測(cè)均設(shè)陰性對(duì)照及熒光補(bǔ)償。將56份陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，立即上機(jī)檢測(cè)，獲取MFI值。此后，避光放置，分別 在 30min、1h、2h、4h、6h、8h 進(jìn) 行 重 新 檢 測(cè) 獲 取MFI值。

1.4 檢測(cè)與結(jié)果判斷 計(jì)數(shù)HLA-B27陽(yáng)性/HLAB27陰性細(xì)胞，同時(shí)記錄其MFI值。若該群占總淋巴細(xì)胞百分比大于90%時(shí)，且其平均熒光強(qiáng)度大于8判為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

56 例陽(yáng)性標(biāo)本中，標(biāo)本放置 30min、1h、2h、4h、6h、8h后檢測(cè)后獲取的MFI值，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

表1 標(biāo)本在放置不同時(shí)間后檢測(cè)的結(jié)果比較(x±s)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱的慢性炎癥性疾病，早期診斷、早期治療具有重要的意義，而HLA-B27與AS的相關(guān)性則是迄今為止已知的HLA與疾病的關(guān)聯(lián)中最強(qiáng)和最典型的[3]。有研究發(fā)現(xiàn)超過(guò)90%的AS患者其HLA-B27表達(dá)陽(yáng)性，而AS由于其癥狀與許多其他疾病相似而難以確診，因此HLA-B27的檢測(cè)結(jié)果對(duì)該病的診斷有重要意義。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-B27主要是根據(jù)直接熒光染色及抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使鼠抗人的B27單克隆抗體與人淋巴細(xì)胞表面B27抗原結(jié)合。而HLA-B27屬交叉反應(yīng)群成員，是由分擔(dān)共同表位的HLA抗原組成的。雖然鼠源的抗HLA-B27的特異性，仍然存在不同程度的交叉反應(yīng)，而且主要是與HLA-B7的交叉反應(yīng)，造成假陽(yáng)性[4]。本實(shí)驗(yàn)中我們采用了雙標(biāo)記的熒光抗體，因此排除了HLAB7的交叉反應(yīng)，從而減少了假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生。

樣品細(xì)胞的分離與固定、抗體標(biāo)記、上機(jī)測(cè)試及數(shù)據(jù)分析是流式檢驗(yàn)的一個(gè)連貫過(guò)程。因此，檢測(cè)過(guò)程中的準(zhǔn)確性與可靠性將直接影響檢驗(yàn)結(jié)果，如：樣本放置時(shí)間、樣本的準(zhǔn)備、固定的選擇、實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)立、免疫熒光標(biāo)記的溫度和時(shí)間及設(shè)門(mén)法對(duì)分析結(jié)果的影響等等。在實(shí)際工作中，我們發(fā)現(xiàn)MFI值隨著樣本暴露時(shí)間而存在著衰減問(wèn)題，特別是對(duì)于大樣本實(shí)驗(yàn)室，熒光隨時(shí)間的衰減會(huì)造成對(duì)于陰陽(yáng)性結(jié)果的判斷誤差。因此，應(yīng)盡量將誤差減少到最低，以得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)必須進(jìn)行光路、流路的校正及熒光補(bǔ)償，使儀器達(dá)到最佳狀態(tài)，每份標(biāo)本都需做陰性對(duì)照，以提高結(jié)果的可靠性。

本研究顯示，樣本立即檢測(cè)和 30min、1h、2h、4h后檢測(cè)的MFI值檢測(cè)之間無(wú)明顯差異，而樣本放置6h、8h后檢測(cè)的MFT值與樣本制備后立即檢測(cè)的MFI值之間有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)[5]的報(bào)道結(jié)果基本一致。因此，制備好的樣本最好在4h內(nèi)檢測(cè)，以提高準(zhǔn)確性。

[1]郝彩霞,劉延香.流式細(xì)胞術(shù)在特發(fā)性血小板減少性紫癱臨床研究中的應(yīng)用[S].安微醫(yī)學(xué),2009(30)2:208-209.

[2] Van Der Linden SJ, Valkenburg HA, Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis: aproposal for modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361-368.

[3]李 維.強(qiáng)直性脊柱炎與HLA-B27[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2002,23(5):295.

[4]張 琰,溫 浩,張朝霞,等.淋巴細(xì)胞HLA-B27抗原的表達(dá)及意義[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(7):622-623.

[5]曹魯寧,張珍珍,仲人前,等.流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞抗原-B27的影響因素[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,22(3):233-234.