探討ELISA法檢測血清結(jié)核桿菌抗原對肺結(jié)核病的診斷價值

張周云，熊國亮

(江西省胸科醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

血清學(xué)診斷結(jié)核病人抗體已有許多報道，但大多情況不是敏感性不夠就是特異性不強[1]。盡管應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)檢測結(jié)核病抗原已有20多年的歷史，但相關(guān)檢測報道較少。近年來由于單克隆抗體制備技術(shù)的提高，取得了高效價的特異性抗體對提高結(jié)核抗原檢測的敏感性和特異性起著至關(guān)重要作用[2-3]。為了探討檢測血清中結(jié)核桿菌抗原對肺結(jié)核病的診斷價值，我們應(yīng)用單克隆抗體，采用ELISA夾心法檢測了139例臨床已確診的活動性肺結(jié)核患者血清中結(jié)核桿菌分泌蛋白desA抗原，現(xiàn)將結(jié)果評價報告如下。

材料與方法

1材料

1.1 標本來源 2010年2月～7月我院結(jié)核內(nèi)科139例活動性肺結(jié)核病住院患者，其中男83例、女56例，平均年齡54.3歲；我院呼吸內(nèi)科、腫瘤科64例非結(jié)核性肺部疾病 (27例肺炎、16例慢性支氣管炎、21例肺癌)住院患者，其中男36例、女28例，平均年齡58.7歲。全部病例根椐臨床表現(xiàn)、體征、X線、CT、細菌學(xué)、細胞學(xué)、生化指標、免疫學(xué)或抗結(jié)核治療有效等進行了確診。所有患者均抽取空腹血分離出血清，每個患者的血清分兩部分，一部分當天檢測，另一部分-20℃冰柜保存。29例健康對照血清來自江西省血液中心獻血員。

1.1 .2試劑 為鄭州安圖綠科生物工程有限公司產(chǎn)品，批號：20090813。

2方法

2.1 (1)取出一定量的包被孔，編號。留空白1孔，2孔加入陰性對照100μl，2孔加入陽性對照 100μl，其余各孔加樣品稀釋液100μl，分別加入血清20μl。(2)在微量振蕩器上振蕩30s使孔內(nèi)液體混合均勻。(3)置37℃下溫育30min。(4)用洗板機洗板6次。(5)每孔分別加入酶結(jié)合物100μl，空白孔不加。(6)重復(fù)操作步驟(3)(4)。(7)每孔中加入底物、顯色劑各 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)10min。(8)加終止液50μl/孔，振蕩混勻，立即用酶標儀450nm/630nm雙波長測定各孔的吸光值。

2.2 結(jié)果判定

2.2 .1結(jié)果有效性 陽性對照孔OD值應(yīng)大于0.8，陰性對照孔OD值應(yīng)小于0.1，否則實驗無效。

2.2 .2 CUT OFF值計算 CUT OFF值=0.1+陰性對照孔平均OD值 (若陰性對照孔平均OD值小于0.05，按 0.05 計算)。

2.2 .3檢測血清OD值≥CUTOFF值時，判為陽性，否則為陰性。

結(jié) 果

1方法學(xué)穩(wěn)定性實驗表明，新鮮血清與-20℃冰柜存放30d的血清的結(jié)核桿菌抗原檢測結(jié)果無差別。

2 139 例活動性肺結(jié)核患者血清結(jié)核抗原檢出的敏感性為84.1%(117/139)；64例非結(jié)核性肺部疾病組結(jié)核抗原陽性率7.81%(5/64)，特異性為92.19%，29例健康對照血清檢測全為陰性結(jié)果。詳見表1。

表1 二組病例及健康對照組結(jié)核抗原檢測結(jié)果

3 139 例活動性肺結(jié)核患者痰涂片抗酸染色和痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果與血清結(jié)核抗原檢出的關(guān)系，詳見表2。

表2 痰涂片和痰培養(yǎng)結(jié)果與血清結(jié)核抗原檢測的關(guān)系

從表中顯示，結(jié)核桿菌抗原測定陽性與痰涂片陽性一致率為92.73%，結(jié)核桿菌抗原陽性與痰培養(yǎng)一致率為93.24%。

討 論

1檢測結(jié)核病患者血清結(jié)核桿菌抗原可以作為結(jié)核桿菌存在的直接證據(jù)，也可以避免結(jié)核病患者因免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的體液免疫檢測或細胞免疫檢測的“假陰性”結(jié)果。一段時間以來，因檢測結(jié)核抗原用的結(jié)核抗體存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)核抗原檢測的特異性和敏感性低下。近年來由于單克隆抗體制備技術(shù)的提高，取得了高效價的特異性抗體，使得臨床上檢測結(jié)核病患者的血清中結(jié)核桿菌抗原成為可能。本實驗采用的單克隆抗體是利用基因工程方法在體外表達結(jié)核分枝桿菌的desA蛋白抗原制備而成[3]，利用該單克隆抗體采用ELISA雙抗體夾心法檢測了139例臨床已確診的活動性肺結(jié)核患者血清中結(jié)核抗原，結(jié)果表明：其敏感性為84.17%，特異性為92.19%。

2實驗結(jié)果也表明，血清在-20℃條件下存放30d與新鮮血清的檢測結(jié)果無差異，有利于標本少的實驗室集中時間檢測。

3表2 中顯示，痰菌陽性患者與血清結(jié)核桿菌抗原檢測陽性的一致性很高 (涂片陽性為92.73%，培養(yǎng)陽性為93.24%)。對菌陰患者血清結(jié)核桿菌抗原檢測陽性為78.57%。

4 64 例非結(jié)核性肺部疾病患者血清中有5例陽性，查閱該5例病歷都沒有合并結(jié)核的情況，為假陽性，因此檢測非結(jié)核性肺部疾病患者的假陽性率為7.81%。

綜上所述，采用ELISA雙抗體夾心法檢測活動性肺結(jié)核患者血清結(jié)核抗原雖有一定的假陽性，但仍有可能成為結(jié)核病敏感性高、特異性強的新型診斷方法。檢測血清中結(jié)核桿菌分泌蛋白dseA抗原對診斷肺結(jié)核病有較高的應(yīng)用價值。

[1]劉金花,彭澤華.血清結(jié)核抗體與特異性CIC測定綜合診斷肺結(jié)核病163例[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗,2006,24(5):441-442.

[2]唐宇龍.三種結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的抗體制備及其在抗原檢測中的應(yīng)用[J].中國傳染病雜志,2007,25(10):597-600.

[3]顧 軍.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白desA的單克隆抗體及其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用[P].中國專利,200710054376.0,2008.11.12.