羊乳中摻入牛乳的間接ELISA定量檢測

薛海燕，胡圍圍，宋宏新,*，韓 燕，楊戰(zhàn)月

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.興平市人民醫(yī)院，陜西 興平 713100)

羊乳中摻入牛乳的間接ELISA定量檢測

薛海燕1，胡圍圍1，宋宏新1,*，韓 燕1，楊戰(zhàn)月2

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.興平市人民醫(yī)院，陜西 興平 713100)

制備抗β-酪蛋白多克隆血清，免疫吸收封閉與羊乳反應(yīng)的抗體，獲免疫吸收抗體用于乳樣的間接ELISA檢測中，建立羊乳中摻入牛乳成分的定量免疫學(xué)方法。實(shí)驗(yàn)表明，該間接ELISA法用于原乳檢測時，摻入牛乳的百分含量與A450nm在4%～50%呈線性關(guān)系，該方法的最低檢出量為4%。所建立的ELISA方法變異系數(shù)＜5%，回收率在94%～105%之間，符合方法學(xué)要求，可用于牛乳摻假的定量檢測。對滅菌乳的檢測表明，熱處理不改變β-酪蛋白與抗體反應(yīng)的特性，方法還可用于經(jīng)熱加工的乳品檢測中。

多克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)；羊乳摻假；牛乳

羊乳及其制品風(fēng)味佳易消化，牛乳過敏者飲用羊乳的不良反應(yīng)較少[1]。我國奶羊養(yǎng)殖多以較小規(guī)模的農(nóng)戶散養(yǎng)為主，羊乳易受到季節(jié)波動影響，羊乳的市場價格比牛乳高，致使羊乳中摻入牛乳的現(xiàn)象時有發(fā)生[2]，這種摻假不僅在液態(tài)羊乳及其制品中，更多地會出現(xiàn)在原料乳的收購過程，急需建立一種適宜于現(xiàn)場快速檢測羊乳摻入牛乳的方法，以確保羊乳制品質(zhì)量和安全。目前報道用于羊乳的乳源性摻假的非免疫學(xué)方法包括氣相色譜[3]、液相色譜、各種電泳(SDS-PADE、IEF、CF)和PCR[4]技術(shù)等，但這些方法難以在線檢測。免疫學(xué)方法的特異性使其較多的用于乳源的區(qū)別檢測中，常用的方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、火箭免疫電泳、紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)等，所需時間較長且抗血清濃度高；而酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)[5-7]方法特異性及靈敏度高，操作方便。本研究以牛乳中β-酪蛋白作為抗原產(chǎn)生多克隆抗體，并對抗體加以修飾，建立適合現(xiàn)場快速檢測的羊乳中摻入牛乳含量的ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳與羊乳(西農(nóng)薩能奶山羊乳) 西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧試驗(yàn)場。辣根過氧化物酶聯(lián)羊抗兔IgG 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 Simga公司；其他試劑分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀 Thermo Electron 公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；YX-280型手提式壓力蒸汽消毒器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；AKTA purifier10蛋白純化層析系統(tǒng)(DEAE-Sephadex A50離子交換色譜柱) GE Healthcare公司；酶標(biāo)板 西安舟鼎國公司。

1.3 抗體的制備

用牛β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品免疫新西蘭白兔。收集血清后采用飽和硫酸銨分級沉淀法分離[8]，再經(jīng)過DEAESephadexA50離子交換色譜純化，所得抗體與α-酪蛋白、κ-酪蛋白及乳清蛋白交叉反應(yīng)小[9]。對多克隆抗體進(jìn)行免疫吸收[10-12]可去除與羊乳β-酪蛋白交叉反應(yīng)的抗體組分，即采用羊β-酪蛋白(2mg/L)與CNBr-活化的瓊脂糖交聯(lián)后，加入純化的多克隆抗體中反應(yīng)4h，清液即為較特異的抗牛β-酪蛋白多克隆抗體(簡稱修飾抗體)，用于牛羊乳的區(qū)別檢測。

1.4 樣品的檢測方法研究

羊乳樣品制備，鮮乳分別經(jīng)62℃水浴30min得巴氏滅菌乳；121℃滅菌20min得高溫滅菌乳；經(jīng)80℃預(yù)熱，板式換熱器137℃條件下間接加熱4s，得UHT滅菌乳。

用間接ELISA法檢測羊乳樣品中摻假牛乳成分。以乳樣品為包被抗原，自制的抗牛β-酪蛋白多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，測定在450nm波長處吸光度(A450nm)，考察ELISA檢測結(jié)果。一抗和酶標(biāo)記抗體的最佳稀釋度經(jīng)過方陣滴定法確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾抗體的特異性

將修飾抗體及非修飾抗體用于脫脂牛羊乳的間接ELISA檢測中，修飾抗體1:80稀釋，酶標(biāo)二抗1:1600稀釋，測定A450nm，結(jié)果如圖1所示。

圖1 未修飾抗體與修飾抗體檢測牛乳、羊乳的間接ELISA曲線Fig.1 Indirect ELISA curves for the identification of bovine milk adulteration in goat milk using unmodified and modified antibodies

圖1 顯示未修飾抗體在采用間接ELISA檢測牛乳和羊乳時，A450nm相似，難于區(qū)別兩種奶樣；而修飾抗體用于檢測時，羊乳A450nm遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于牛乳，可用于羊乳和牛乳樣品的區(qū)別檢測。經(jīng)修飾后的β-酪蛋白多克隆抗體已經(jīng)除去與可與羊乳中抗原反應(yīng)的抗體，以下的間接ELISA反應(yīng)均采用修飾后的多克隆抗體。

2.2 樣品最適稀釋度的選擇

將脫脂牛乳以2n倍比稀釋，以ELISA稀釋液陰性對照，修飾抗體1:160稀釋，酶標(biāo)二抗1:1000，測定A450nm，結(jié)果見圖2。

圖2 不同脫脂牛乳包被稀釋度與A450nm值的關(guān)系Fig.2 Relationship between the concentration of coated bovine milkand A450nm

從圖2可以看出，脫脂牛乳稀釋度的增加對A450nm影響并不是很大，當(dāng)脫脂牛乳的稀釋度在1:26時，A450nm為1.0以上，且P/N值相差最大。因此選擇脫脂牛乳樣品的包被稀釋度為1:26。

2.3 間接ELISA方法在3種樣品摻假檢測中應(yīng)用

將牛乳樣品按梯度摻入羊乳樣品后，經(jīng)過不同方式處理，用建立的間接 ELISA 實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測。各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣都設(shè)立3個平行孔，求出它們吸光度的均值。然后以摻入牛乳的百分含量為橫坐標(biāo)，以A450nm為縱坐標(biāo)作圖，得到摻入牛乳含量與A450nm的關(guān)系圖。

2.3.1 脫脂羊乳摻假檢測的間接ELISA結(jié)果

圖3 脫脂羊乳中摻入牛乳體積分?jǐn)?shù)與A450nm值關(guān)系圖Fig.3 Relationship between A450nm and the concentration of bovine milk adulteration in goat milk

將脫脂牛乳按梯度0、2、5、10、20、30、40、50、70、100%體積分?jǐn)?shù)摻入脫脂羊乳中作為待檢樣品，以建立的間接 ELISA方法檢測，摻入牛乳含量與A450nm的關(guān)系如圖3所示。

當(dāng)脫脂羊乳中所摻入牛乳體積分?jǐn)?shù)在50%以下時，A450nm與其呈線性關(guān)系，當(dāng)摻入牛乳體積分?jǐn)?shù)高于50%時，由于乳中蛋白質(zhì)含量太高，在包被酶標(biāo)板吸附時形成多層吸附，未直接吸附在酶標(biāo)板上的蛋白在洗滌操作中被洗去，因此摻入的牛乳高于50%時，其吸光度幾乎達(dá)到一個平臺維持不變。低于50%時的回歸方程為A450nm=0.196＋0.0186B，其中B代表摻入牛乳的體積分?jǐn)?shù)，R2=0.999。因此，這一線性關(guān)系可以作為判斷脫脂羊乳中摻入牛乳含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際檢測時，每批次的ELISA中都設(shè)一組孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 滅菌羊乳摻假檢測的間接ELISA結(jié)果

圖4 牛羊乳混合滅菌后的間接ELISA檢測結(jié)果Fig.4 Indirect ELISA detection results in milk mixture samples

實(shí)驗(yàn)初步研究受熱處理后的乳品對間接ELISA的影響。將脫脂牛乳按相同梯度0～100%體積分?jǐn)?shù)摻入羊乳中做不同熱處理后作為待檢樣品，間接 ELISA檢測結(jié)果如圖4所示。羊乳中所摻入脫脂牛乳含量與A450nm的關(guān)系趨勢與未熱處理加工乳相似。即在摻入量大于50%后，檢測所得A450nm幾乎不再增加。

由此可知，在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過巴氏滅菌、高溫滅菌及UHT滅菌乳的混合乳樣品的免疫化學(xué)活性改變不大，也就是說熱處理不影響吸附在酶標(biāo)板上的牛乳β-酪蛋白的相應(yīng)抗原表位。同時從ELISA稀釋液替代羊乳的A450nm與混合乳相似可知，羊乳本底非常小，該ELISA可完全特異檢測牛乳的存在。當(dāng)羊乳中所摻入牛乳含量在5%～50%滅菌乳中，A450nm與摻入牛乳量呈線性關(guān)系。2.4羊乳中摻入牛乳成分檢測的間接ELISA方法的評價指標(biāo)

2.4.1 羊乳中摻入牛乳成分的最低檢出量

在實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件下，經(jīng)3組平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測混合樣品中牛乳成分，按間接ELISA操作流程檢測獲得最小檢出量。所得結(jié)果如表1。脫脂乳品的最低檢出量為4%，接近國外采用哺乳動物抗血清免疫方法檢出量[13-15]。

表1 羊乳中摻入脫脂牛乳含量敏感性實(shí)驗(yàn)平均值表Table 1 Sensitivity test for the indirect ELISA

2.4.2 羊乳中摻入牛乳成分檢測的重復(fù)性及回收率實(shí)驗(yàn)

取不同混合量的樣品包被酶標(biāo)板，用己經(jīng)建立的間接ELISA反應(yīng)系統(tǒng)檢測，測A450nm，每個樣品6孔重復(fù)，計算變異系數(shù)(CV)。比較檢驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，結(jié)果如表2所示。

表2 脫脂乳的間接ELISA重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 2 Reproducibility test for the indirect ELISA

從表2可以看出，板內(nèi)檢測羊乳中摻入牛乳成分的A450nm的變異系數(shù)(CV)小于5%，說明板內(nèi)檢測樣品的重復(fù)性良好，系統(tǒng)穩(wěn)定。所建立的間接ELISA檢測羊乳中摻入牛乳成分含量具有良好的重復(fù)性。在同時重復(fù)性試驗(yàn)的同時，以已知摻入8%、15%、25%及35%的乳樣品(重復(fù)3個平行)做回收率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)回收率在94%～105%之間，所建立的ELISA能夠在4%～50%之間滿足定量檢測的要求。當(dāng)摻假超出50%時，乳樣能夠表現(xiàn)出味道或熱性質(zhì)的變化，或通過再稀釋測得相應(yīng)量，而小于4%的摻假量并不能獲得較高利益，所以采用該方法建立的快速檢測可用于防止羊牛乳樣品的摻假。

3 結(jié) 論

通過對抗β-酪蛋白多克隆抗血清的免疫吸收，獲得能夠區(qū)別牛羊乳的多克隆抗體，建立了一種能夠定量檢測羊乳中牛乳成分的摻假的間接ELISA方法，檢測線性范圍為4%～50%，檢測最低限為4%，本方法的靈敏度與國內(nèi)外同類方法相近，低于PCR檢測，但是該檢測方法操作靈活，在現(xiàn)場乳品收購檢測時可直接根據(jù)顏色反應(yīng)判定是否摻假，在實(shí)驗(yàn)室中又可根據(jù)吸光度的測定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測用于質(zhì)量控制監(jiān)督。研究羊鮮乳、酪蛋白及熱加工處理的乳品摻入牛乳成分的檢測，結(jié)果顯示該ELISA均具有良好適用性。

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Indirect ELISA for Detection and Quantification of Bovine Milk in Goat Milk

XUE Hai-yan1，HU Wei-wei1，SONG Hong-xin1,*，HAN Yan1，YANG Z,han-yue2
(1. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi an 710021, China；2. The People , s Hospital of Xingping, Xingping 713100, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for the detection and quantification of bovine milk adulteration in goat milk. The polyclonal antibodies were modified by mixed them with goat milk for the assay. The absorbance at 450 nm in indirect ELISA revealed a linear relationship with the concentration of adulterated bovine milk at the range of 4%-50%. Detection limit was 4% for mixed milk samples. The assay was characteristics of high reproducibility with intra- and inter-assay variation coefficients less than 5%. The recovery rate of spiked samples was in the range of 94%-105%. Therefore, the ELISA can successfully use to determine the adulteration of milk samples, which is suitable for developing a kit in routine inspection of milk.

polyclonal antibody；ELISA；goat milk adulteration；bovine milk

Q51

A

1002-6630(2010)24-0370-04

2010-07-21

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目(2009K02-09)；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目(09JC19)；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)(2010JK425)

薛海燕(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称访庖邫z測技術(shù)。E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn

*通信作者：宋宏新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：songhx@sust.edu.cn