高效液相色譜法測(cè)定刺玫果中金絲桃苷的含量

鐘方麗，王曉林*，敬采月

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

高效液相色譜法測(cè)定刺玫果中金絲桃苷的含量

鐘方麗，王曉林*，敬采月

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

目的：建立刺玫果中金絲桃苷含量測(cè)定的方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；以甲醇(A)和0.2%磷酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm；柱溫40℃。結(jié)果：金絲桃苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度在4.76～76.16μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9993。平均回收率為98.06%，RSD為1.72%。結(jié)論：采用高效液相色譜法測(cè)定刺玫果中金絲桃苷的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可以用于刺玫果的質(zhì)量控制。

刺玫果；金絲桃苷；高效液相色譜法

刺玫果系薔薇科薔薇屬植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果實(shí)，又名野薔薇果，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高、藥食同源的野生果類。廣泛分布于東北及內(nèi)蒙、山西等省。《中藥大辭典》謂其有健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的作用[1]。刺玫果含有大量的維生素、氨基酸、黃酮類和鞣質(zhì)類化合物[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃酮類物質(zhì)可加快血液流速，降低血液黏度，用于治療腦血栓、腦動(dòng)脈硬化及冠心病等，其中黃酮類成分——金絲桃苷對(duì)心肌缺血、腦缺血損傷均有保護(hù)作用，還具有調(diào)節(jié)免疫作用[3]。

目前，以天然刺玫果為主要成分的保健藥物、保健食品、功能性飲料日益被人們所重視并廣泛開發(fā)[4]。尚未見有關(guān)刺玫果中金絲桃苷含量測(cè)定的研究，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定刺玫果中金絲桃苷的含量，建立刺玫果中金絲桃苷的含量測(cè)定方法，為刺玫果的質(zhì)量控制、綜合利用與開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果由延吉市林業(yè)局提供，經(jīng)吉林化工學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果實(shí)。

金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)111521-200303) 中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純) 天津大茂化學(xué)試劑公司；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AB 型液相色譜儀、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器 日本島津儀器有限公司；Shim-pack VP-ODS C18色譜柱；BP211D 型電子天平 Sartorius公司；RT-08手提式高速中藥粉碎機(jī) 大德樂機(jī)械有限公司；JBT/CYCL型超聲波藥品處理機(jī) 濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.2%磷酸溶液(V/V)，程序?yàn)?～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A[5-7]；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為 360nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇配制成95.20μg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液[8-9]。

1.3.3 供試樣品溶液的制備

精密稱取2.50g刺玫果藥粉，加入20mL甲醇，超聲提取30min，過濾，收集提取液，濾渣加15mL甲醇，超聲提取20min，過濾，合并兩次提取液，過濾，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜法測(cè)定金絲桃苷含量時(shí)，一般分別在350[6]、355[10]、360[11]、370nm[12]的檢測(cè)波長(zhǎng)條件下測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列紫外檢測(cè)器對(duì)金絲桃苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)200～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷在360nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，金絲桃苷在360nm處靈敏度較高，峰形較好，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)[8]確定360nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液[6]，實(shí)驗(yàn)中分別考察等度洗脫和梯度洗脫兩種方式，等度洗脫主要考察甲醇-0.2%磷酸溶液配比分別為35:65、40:60、50:50時(shí)金絲桃苷峰的出峰時(shí)間和峰型情況，結(jié)果配比為35:65時(shí)峰型較差，配比為50:50時(shí)出峰時(shí)間太短為3.287min，配比為40:60時(shí)出峰時(shí)間為6.8min，峰型較好，故選擇甲醇-0.2%磷酸溶液(40:60)為流動(dòng)相，雖然采用等度洗脫的方式出現(xiàn)的色譜峰型良好，標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間在6.8min左右，但由于刺玫果為天然植物，成分復(fù)雜，在這樣短的時(shí)間內(nèi)可能會(huì)有一些物質(zhì)沒有分開而堆積到一起，金絲桃苷峰與其他組分不能有效分離，這樣就不能保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和可靠性，于是在等度洗脫的基礎(chǔ)上又進(jìn)行梯度洗脫，而梯度洗脫金絲桃苷出峰時(shí)間約為26min左右，峰型良好，與其他組分能夠有效分離，故以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并且對(duì)流動(dòng)相的配比進(jìn)行探索，結(jié)果以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，程序?yàn)?～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A，在此條件下樣品與標(biāo)準(zhǔn)品均分離較好，整個(gè)洗脫時(shí)間為65min，出峰時(shí)間約為26min左右，故選擇在上述流動(dòng)相條件下進(jìn)行研究。

2.1.3 分離柱的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，選擇的色譜柱為Shim-pack VPODS C18(4.6mm×150mm，5μm)。

2.2 供試品溶液制備方法的選擇

采用70%乙醇加熱回流提取，甲醇超聲提取兩種方法處理樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法所測(cè)出的金絲桃苷含量相差很少，但是甲醇超聲提取方法較70%乙醇加熱回流提取操作簡(jiǎn)單、損失較少，故確定超聲提取方法作為供試品溶液處理方法。

2.2.1 提取次數(shù)的選擇

精密稱取5.0302g刺玫果粉末，分別提取1、2、3、4次，每次加入20mL甲醇，每次超聲提取30min，過濾，收集各次提取液，將各次提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，進(jìn)行含量測(cè)定。由圖1可知，第1、2次提取液測(cè)得的金絲桃苷峰面積分別為3703.5、1942.4，經(jīng)計(jì)算提取率達(dá)97.5%，結(jié)果表明超聲提取2次刺玫果中的金絲桃苷幾乎提取完全。

圖1 超聲提取次數(shù)對(duì)金絲桃苷提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extracting times on extraction efficiency of hyperin

2.2.2 提取時(shí)間的選擇

在提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，精密稱取5.0280g刺玫果粉末，提取2次，每次加入20mL甲醇，第1次提取30min，第2次分別提取10、20、30、40min，將第2次的提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容。用微孔過濾器(0.45μm)過濾，取濾液作為供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。由圖2可知，超聲提取20min，金絲桃苷含量與30min和40min很接近，故超聲時(shí)間定為20min。

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)金絲桃苷提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extracting time on extraction efficiency of hyperin

2.2.3 提取溶劑用量的選擇

在提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)提取效果影響的基礎(chǔ)上，考察甲醇用量對(duì)提取效果的影響，精密稱取5.0178g刺玫果粉末，提取2次，第1次加入20mL甲醇，提取30min，第2次分別加入甲醇10、15、20、25mL，提取20min，將第2次的提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，用微孔過濾器(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。

圖3 溶劑量對(duì)金絲桃苷提取效果的影響Fig.3 Effect of different volume of solvent on extraction efficiency of hyperin

由圖3可知，溶劑用量為15、20、25mL時(shí)測(cè)得的金絲桃苷的量相差不大，因此選用15mL提取。最終確定供試品溶液的制備方法[6,13]為超聲2次，第1次加入20mL甲醇，超聲30min，第2次加入15mL甲醇，超聲20min，合并提取液，過濾，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍考察

精密吸取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(95.20μg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度4.76、9.52、19.04、38.08、57.12、76.16μg/mL的梯度溶液。分別精密吸取20μL，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。得回歸方程A=453.11C-331.80，r=0.9993，結(jié)果表明金絲桃苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度在4.76～76.16μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為19.04μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定金絲桃苷吸收峰面積，RSD為1.06%，結(jié)果說明精密度良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision test of this method

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試樣品溶液，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)行測(cè)定，記錄金絲桃苷吸收峰的峰面積，結(jié)果RSD為0.72%。結(jié)果表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Stability test of this method

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批刺玫果藥粉，按1.3.3節(jié)方法制備5份供試品溶液，依法測(cè)定金絲桃苷的含量，記錄金絲桃苷吸收峰的峰面積，結(jié)果RSD為1.60%。說明此方法重復(fù)性較好(表3)。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Reproducibility test of this method

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量(139.51μg/g)的樣品5份，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液3.6mL，按1.3.3節(jié)方法制備5份供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明平均回收率為98.06%，RSD為1.72%實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery experiments

2.4 樣品測(cè)定

圖4 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of hyperin reference solution

圖5 供試品溶液色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of hyperin sample solution

分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4、5。在此條件下供試品溶液中金絲桃苷的保留時(shí)間約為26min左右，分離度大于1.5，理論板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)算為7862，說明色譜條件適合本品的測(cè)定。

取3份刺玫果樣品，按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，測(cè)得金絲桃苷的含量分別為133.91、139.51、141.01μg/g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法操作合理簡(jiǎn)便，方法精密度高，重復(fù)性及線性關(guān)系良好，回收率較好，可為含刺玫果的中藥制劑和功能性食品的含量測(cè)定提供依據(jù)。

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Determination of Hyperin in Rosa davurica Pall. by HPLC

ZHONG Fang-li，WANG Xiao-lin*，JING Cai-yue
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

Objective: To establish a determination method for hyperin in Rosa davurica Pall.. Methods: A HPLC method was developed using Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) column as the stationary phase and CH3OH-0.2% H3PO4as the mobile phase. The flow rate of mobile phase, injection volume of the sample and the column temperature were 1.0 mL/min, 20 μL and 40 ℃, respectively. The UV detection wavelength was 360 nm. Results: A good linear relationship between integral value of peak area and hyperin concentration in the range of 4.76-76.16 μg/mL (r = 0.9993) was observed. The average recovery rate of hyperin was 98.06% with the RSD of 1.72%. Conclusion: The HPLC determination of hyperin in Rosa davurica Pall. was characteristics of convenience and accuracy, which can be used for the quality control of Rosa davurica Pall..

Rosa davurica Pall.；hyperin；HPLC method

TQ244.2

A

1002-6630(2010)24-0281-04

2010-02-08

吉林省教育廳重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目(吉教科合字[2006]第122號(hào))

鐘方麗(1970—)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及其生物活性的研究。E-mail：fanglizhong@sina.com

*通信作者：王曉林(1969—)，男，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及純化工藝研究。E-mail：wangxiaolin69@eyou.com