牛乳中氨芐青霉素殘留的受體分析法測定

孫永海，張 杰，韓 勇，李倬琳，李鐵柱,*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130124；3.中國國際工程咨詢公司，北京 100048)

牛乳中氨芐青霉素殘留的受體分析法測定

孫永海1，張 杰2，韓 勇3，李倬琳2，李鐵柱2,*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130124；3.中國國際工程咨詢公司，北京 100048)

建立基于受體識別技術(shù)檢測牛乳青霉素類抗生素殘留的新方法。通過生物技術(shù)制備與青霉素類抗生素具有高度親和力的受體蛋白質(zhì)，進(jìn)而以其為識別元件開發(fā)間接競爭氨芐青霉素殘留檢測方法。青霉素受體包被質(zhì)量濃度5μg/mL，生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度500ng/mL條件下，對其殘留量進(jìn)行測定，檢出限為2μg/kg，有較好的精密度及回收率。在樣品中殘留的青霉素種類已知的前題下(以氨芐青霉素為例)，本方法可以作為定量篩選方法。

牛乳；氨芐青霉素；受體分析；生物素；親和素

青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢菌素、鄰氯青霉素等具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用于醫(yī)治奶牛的乳腺炎，尤其是氨芐青霉素，由于其廣譜并廉價因此被大量地使用，且被頻繁地以超劑量使用，由此導(dǎo)致牛乳中含有高濃度氨芐青霉素的殘留問題[1]。雖然青霉素類藥物本身對機(jī)體沒有很強(qiáng)的毒性，但是青霉素類藥物會使一些個體產(chǎn)生十分劇烈的過敏反應(yīng)[2-3]。如果長期攝入含有抗生素的牛乳會使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，從而導(dǎo)致致病菌、條件致病菌大量繁殖引起全身或局部的感染[4]。經(jīng)常食用抗生素殘留的食品還會使人體產(chǎn)生以抗生素為營養(yǎng)源的超級細(xì)菌，當(dāng)這些細(xì)菌引起感染性疾病時，就會給臨床治療帶來巨大的困難[5]。另外，從乳品加工的角度看，原料乳中抗生素殘留物嚴(yán)重干擾發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，抗生素可嚴(yán)重影響干酪、黃油、發(fā)酵乳的起酵和后期風(fēng)味的形成[6]。

因此，許多國家對牛乳中的青霉素類藥物尤其是氨芐青霉素殘留的管理十分嚴(yán)格，歐盟規(guī)定的氨芐青霉素在牛乳中的限量為4μg/kg[7]。我國對乳制品中的青霉素殘留也日益重視，農(nóng)業(yè)部新近出臺的《生鮮牛乳收購標(biāo)準(zhǔn)》修訂版也將青霉素殘留列為強(qiáng)制性必測項目，最大殘留限量規(guī)定為4μg/kg[8]。常用的青霉素殘留檢測篩選方法大體分為微生物生長抑制法和受體吸附法。微生物生長抑制法具有操作簡便，低成本的優(yōu)勢，但是它也具有不能定量、特異性差、易假陽性的缺點，不能完全滿足青霉素殘留檢測的需要[9-10]。受體吸附法卻一種可以定量，專一性強(qiáng)，靈敏度高，自動化程度高的檢測方法，但是在我國起步較晚，實際應(yīng)用主要依賴進(jìn)口試劑盒[11]。

將青霉素受體PBP 2x[12]包被于微孔板，首先加入待測乳樣，使其中所含氨芐青霉素與PBP 2x的青霉素結(jié)合位點的非競爭性結(jié)合；然后加入生物素標(biāo)記的氨芐青霉素與剩余的PBP 2x青霉素結(jié)合位點結(jié)合生成PBP 2x-生物素-氨芐青霉素復(fù)合物，進(jìn)而應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素檢測此復(fù)合物，旨在建立生物素-親和素放大體系結(jié)合受體分析法檢測牛乳中氨芐青霉素殘留的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

肺炎鏈球菌D39由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院吳忠道教授惠贈；pGEX-6P-1由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院金英花教授惠贈；其余質(zhì)粒及菌種均為本室保存。

各種限制性內(nèi)切酶、連接酶 大連寶生物工程公司。Taq酶、dNTP、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 鼎國生物工程公司；PCR引物由鼎國生物工程公司合成并經(jīng)PAGE純化；Glutathione-Sepharose 4B親和柱、Sephacryl S 100 Pharmacia公司；氨芐青霉素、四環(huán)素、DNA及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) Sigma公司；生物素、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 北京博奧森公司；其他試劑為分析純。

Multiskan Ascent V1.24 酶標(biāo)儀 芬蘭雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

各種基因工程基本操作均參考文獻(xiàn)[13]中有關(guān)章節(jié)，按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括：10× Taq plusI DNA 聚合酶緩沖液5μL，dNTP(10μmol/L) 1μL，5＇端引物(10μmol/L)0.5μL，3＇端引物(10μmol/L) 0.5μL，TaqDNA聚合酶(4U/μL)0.5μL，模板 cDNA 2μL，加水補(bǔ)充總體積至 50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性1min，60℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)后72℃保溫10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物以凍融法回收，首先被克隆進(jìn)pGEM-T 載體，并且插入含有糾錯DNA序列然后再進(jìn)一步克隆進(jìn) pGEX-6P-1。DNA序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測定。

1.2.2 青霉素受體的表達(dá)與純化

本研究PBP2x重組融合蛋白表達(dá)純化方法對Cacciatore等[14]報道的方法做部分改進(jìn)。具體方法如下：原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-tet-PBP 2x轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21，挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，接種10mL YTY培養(yǎng)基中(16g胰蛋白胨、10g酵母膏、5gNaCl和15mg四環(huán)素/L)于37℃ 220r/min培養(yǎng)過夜，過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接100mL YTY培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng) 1～2h，加入IPTG誘導(dǎo) 4～6h，4℃、6000r/min離心15min收獲菌體。菌體重懸于PBS(10mL/g)濕菌體，置冰浴中，溫和超聲破碎細(xì)胞。加入Triton X-100至體積分?jǐn)?shù)1%，室溫條件下緩慢攪拌30min，4℃、12000r/min 離心15min，收集上清液。過以10倍體積的PBS和10倍體積的含體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100 的PBS平衡好的Glutathione-Sepharose 4B親和柱，以20倍柱體積的PBS洗去雜蛋白，親和柱中加入凝血酶，25℃反應(yīng)12～16h，收集酶切反應(yīng)液，上樣于經(jīng)過10mmol/L NH4HCO3溶液預(yù)平衡Sephacry S 100層析柱(2.6cm×80cm)，以10mmol/L NH4HCO3溶液洗脫，收集洗脫峰，濃縮，純化后的PBP 2x儲存在-20℃體積分?jǐn)?shù)10%甘油溶液中。

1.2.3 氨芐青霉素偶聯(lián)生物素

生物素標(biāo)記氨芐青霉素(B-AMPI)操作步驟如下[15]：4mg NHS修飾的Biotin(BNHS)和10mg 氨芐青霉素溶于200μL二甲基甲酰胺，隨后在室溫緩慢搖振反應(yīng)4h。最后將反應(yīng)后的溶液滴加到15mL冰水中，過濾沉淀, 并用冷水洗5次，真空干燥。 以CH2Cl2-MeOH (體積比9:1)為洗脫劑，用柱色譜提純B-AMPI并用HPLC 檢測純度99%。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

氨芐青霉素溶于PBS緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，向已知無抗奶中加入此溶液調(diào)配含氨芐青霉素質(zhì)量濃度一定的標(biāo)準(zhǔn)樣品。隨后，標(biāo)準(zhǔn)樣品置于搖床15min充分混勻。

1.2.5 受體吸附分析步驟

4℃條件下，一定量青霉素受體PBP 2x固定在微孔板表面(加蓋)過夜。在使用0.01mol/L PBS緩沖溶液(1.47g/L Na2HPO4，0.43g/L KH2PO4和 6.79g/L NaCl；pH7.2)沖洗后，繼續(xù)使用2%酪蛋白溶液封閉來避免非特異性吸附。然后使用PBS緩沖溶液沖洗3次，加100μL脫脂后的待測樣品(做3個平行樣)。如果樣品中含有青霉素類抗生素，青霉素將被青霉素受體PBP 2x所吸附并依據(jù)含量部分或全部占據(jù)其青霉素結(jié)合靶點。在恒溫條件下培養(yǎng)30min后，加入100μL生物素化氨芐青霉素以占據(jù)余下的青霉素結(jié)合位點。經(jīng)過30min培養(yǎng)后，使用清洗溶液(8.55g/L NaCl 和0.25mL/L Tween-20)及PBS緩沖溶液清洗兩次，加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(1:1500)培養(yǎng)30min以特異性吸附PBP 2x與生物素化氨芐青霉素復(fù)合體。使用清洗溶液和PBS緩沖溶液沖洗微孔板之后，加入100μL酶底物溶液。在反應(yīng)進(jìn)行10min后加入100μL 1mol/L HCl(H2SO4)以終止酶反應(yīng)。若樣品中含有青霉素殘留，PBP 2x與生物素化氨芐青霉素復(fù)合物的生成量也就會少些，則復(fù)合物所能吸附的酶標(biāo)親和素的量相應(yīng)的也會少些，最終導(dǎo)致酶解液的吸光度變小。即樣品中的青霉素濃度與微孔中酶解液的吸光度呈反比。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 青霉素受體PBP 2x包被質(zhì)量濃度的選擇

在樣品氨芐青霉素殘留量為零，生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度為1000ng/mL條件下，做青霉素受體包被質(zhì)量濃度單因素試驗，結(jié)果見圖1。當(dāng)青霉素受體包被質(zhì)量濃度低于5μg/mL時，在450nm波長處所測得的吸光度(每次測量前搖振15s)隨包被質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)青霉素受體包被質(zhì)量濃度高于5μg/mL時，吸光度隨包被質(zhì)量濃度的增加而減?。灰虼舜_定最佳青霉素受體包被質(zhì)量濃度為5μg/mL。

圖1 PBP 2x包被質(zhì)量濃度單因素試驗Fig.1 Screening of PBP 2x concentration in single factor experiments

2.1.2 生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度的選擇

在樣品氨芐青霉素殘留量為零，青霉素受體PBP 2x包被質(zhì)量濃度5μg/mL條件下，做生物素化氨芐青霉素濃度單因素試驗，試驗結(jié)果見圖2。當(dāng)生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度低于500ng/mL時，在450nm波長處所測得的吸光度隨生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度的增加而增加且幅度較大，而當(dāng)生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度高于500ng/mL時，吸光度隨生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度增加幅度逐漸變緩，確定最佳生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度為500ng/mL。

2.2 牛乳中氨芐青霉素的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度

圖2 生物素化氨芐青霉素質(zhì)量濃度單因素試驗Fig.2 Screening of B-AMPI concentration in single factor experiments

在最優(yōu)化條件下做牛乳中氨芐青霉素殘留質(zhì)量濃度與響應(yīng)率(A/A0)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算了各個數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見圖3。

響應(yīng)率/%=A/A0= A樣品/A陰性對照×100

標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)四參數(shù)公式：y=(A1-A2)/[1+(x/x0)p]+A2；

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=(101.87-4.29)/[1+(x/13.89)1.263]+ 4.29(R=0.98)。

同時測定了10個空白樣品值，平均值y值為94.51，s=0.058，y-2s=94.39，帶入擬合曲線，得該方法的檢出限為2μg/kg。

圖3 牛乳中氨芐青霉素殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of ampicillin residues in milk

2.2.2 精密度及回收率實驗

表1 精密度實驗結(jié)果(n=18)Table 1 Precision of the experiments for the determination of ampicillin residues (n=18)

為測定批內(nèi)誤差，本實驗測定了3 個不同含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品(n=6)；為了測定批間誤差，連續(xù)3d對不同批次的3 個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行測定(n=18)，結(jié)果見表1。表2為測定3個不同含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率(n=6)。測定結(jié)果表明：此方法具有很好的精密度及回收率，適合于定量分析牛乳中的氨芐青霉素殘留。

表2 回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of recovery experiments for the determination of ampicillin residues (n=6)

3 結(jié) 論

本實驗建立了受體分析結(jié)合生物素親和素放大體系快速檢測牛乳中氨芐青霉素殘留的新方法，并通過單因素試驗進(jìn)一步優(yōu)化得到青霉素受體最佳包被質(zhì)量濃度為5μg/mL，最佳生物素化青霉素質(zhì)量濃度為500ng/mL。更進(jìn)一步建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗結(jié)果表明，此方法專一性強(qiáng)，靈敏度高，自動化程度高，同時具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 對于氨芐青霉素檢出限可達(dá)2μg/kg，批內(nèi)誤差低于10%，批間誤差在10.8%～12.8%之間，在3個質(zhì)量濃度水平所做回收率在97.7%～102.3%之間。作為一種快速篩選方法，完全可以滿足乳品工業(yè)對牛乳中氨芐青霉素殘留檢測的要求。

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Determination of Ampicillin Residues in Milk by Receptor-binding Assay

SUN Yong-hai1，ZHANG Jie2，HAN Yong3，LI Zhuo-lin2，LI Tie-zhu2,*
(1. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130025, China；2. Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130124, China；3. China International Engineering Consulting Corporation, Beijing 100048, China)

The receptor has been utilized to develop a novel microplate assay for the determination of ampicillin with intact beta-lactam structure in milk. The receptor with high affinity to penicillin is produced by biotechnology. Then the receptor is employed as an identification unit to develop an indirect competitive receptor-binding assay. The detection limit of ampicillin was 2 μg/kg in milk. The assay has been developed as screening test with the option for a quantitative assay, when the identity of the residual beta-lactam is known.

milk；ampicillin；receptor binding assays；biotin；avidin

S859. 84

A

1002-6630(2010)24-0255-04

2010-01-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(nycytx-0502)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903043)；中國博士后科學(xué)基金項目(20100471246)；吉林省博士后科研項目(04006)

孫永海(1956—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)智能檢測與評價研究。E-mail：sunyh@jlu.edu.cn

*通信作者：李鐵柱(1978—)，男，副研究員，博士，主要從事食品有害殘留檢測的研究。E-mail：ltzjlu@126.com