噬菌體檢測食源性致病菌的研究進(jìn)展

李 萌，王靜雪*，林 洪

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

噬菌體檢測食源性致病菌的研究進(jìn)展

李 萌，王靜雪*，林 洪

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。傳統(tǒng)的檢測手段已經(jīng)不能滿足食品安全快速檢測的要求，食源性致病菌的檢測技術(shù)面臨著由耗時、費(fèi)力的傳統(tǒng)方法向省時、簡便的現(xiàn)代檢測技術(shù)轉(zhuǎn)變的挑戰(zhàn)。噬菌體作為細(xì)菌的天敵，具有結(jié)構(gòu)簡單、專一性強(qiáng)、分布廣泛、繁殖速度快的特點(diǎn)?，F(xiàn)今已有很多噬菌體檢測食源性致病菌的方法，這些方法方便、快速、高度特異性，特別是當(dāng)檢測費(fèi)用成為重要的考慮因素時，更有優(yōu)勢。本文對噬菌體檢測食源性致病菌的技術(shù)原理及其應(yīng)用進(jìn)行分類綜述和分析。

噬菌體；致病菌；檢測方法

食源性疾病是人體攝入致病微生物、毒素或化學(xué)物質(zhì)污染的食品而引起感染性或中毒性癥狀的疾病。大量的食源性疾病都是由致病性微生物引起，其臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、痙攣、腹痛和腹瀉等。常見的食源性致病菌有沙門氏菌(S a l m o n e l l a)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌O157:H7 (Escherichia coli O157:H7)、志賀氏菌(Shigella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。在世界醫(yī)藥和公共衛(wèi)生領(lǐng)域內(nèi)，需要建立快速、靈敏以及精確的方法來檢測食源性致病菌。傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)、生理生化鑒定等技術(shù)手段已經(jīng)滿足不了食品安全快速檢測的要求，食源性致病菌的檢測技術(shù)面臨著由耗時費(fèi)力的傳統(tǒng)方法向省時簡便的現(xiàn)代檢測技術(shù)轉(zhuǎn)變的挑戰(zhàn)。

目前食源性致病菌的快速檢測多采用免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的快速檢測。免疫學(xué)檢測方法是以抗原與抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)建立的，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法簡便，但是靈敏度和特異性有待提高，而且在有些情況下結(jié)果不能夠被培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[1]；分子生物學(xué)法，如依賴DNA體外擴(kuò)增原理的DNA指紋圖譜技術(shù)、多重PCR檢測技術(shù)、實(shí)時定量PCR等檢測技術(shù)具有較高的檢測靈敏度，但是儀器和試劑盒成本昂貴，對操作技術(shù)要求高；基因芯片技術(shù)利用相關(guān)細(xì)菌的特異性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因)和基因庫中的rDNA序列設(shè)計玻片上的片段可快速、準(zhǔn)確地檢測和鑒定食品中的病原菌，但是該方法也有一定的缺點(diǎn)，如背景干擾比較大、從不同細(xì)菌中分離出來的RNA的完整性不同、實(shí)驗(yàn)室費(fèi)用高等；蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能滿足食品致病菌檢測快速、準(zhǔn)確度高的要求，但是芯片

的制作仍是一項(xiàng)還不完全成熟的技術(shù)。以上這些現(xiàn)代化檢測方法不同程度地改進(jìn)了傳統(tǒng)方法檢測成本高、速度慢、效率低、盲目性等缺點(diǎn)，但或多或少都存在不足之處。隨著生物、化學(xué)以及計算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，噬菌體檢測致病菌的方法以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，吸引了越來越多科學(xué)家的研究興趣，本文就噬菌體檢測食源性致病菌的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 噬菌體簡介

噬菌體(bacteriophage或phage)是一類感染細(xì)菌的病毒，主要由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成，可以通過蛋白質(zhì)外殼與宿主菌表面的受體特異性結(jié)合，將其遺傳物質(zhì)DNA或RNA注入宿主菌體內(nèi)。最簡單的噬菌體只有10多個基因，最復(fù)雜的噬菌體有數(shù)百個基因。凡是有細(xì)菌的地方，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。據(jù)估計，自然界中細(xì)菌的數(shù)量大約為1030個，假如每個細(xì)菌有10種對應(yīng)的噬菌體，那么噬菌體的數(shù)量將達(dá)到1031個之巨[2]。

圖1 噬菌體的繁殖途徑Fig.1 Propagation styles of bacteriophage

噬菌體的繁殖一般分為5個階段，即吸附、侵入、增殖、裝配和裂解。凡在短時間內(nèi)能夠連續(xù)完成以上5個階段而實(shí)現(xiàn)其繁殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體(virulent phage)，反之則稱為溫和噬菌體(temperate phage)。烈性噬菌體感染細(xì)胞后可立即在宿主細(xì)胞內(nèi)開始自身的生命循環(huán)，引起細(xì)菌細(xì)胞的裂解，而且具有廣譜的裂解宿主性(圖1中步驟(1)至(7)所示)。溫和型噬菌體感染細(xì)胞后有2條途徑：一是裂解途徑(l y t i c c y c l e)，這與烈性噬菌體一樣；另一條是溶源途徑(lysogenic cycle)。溶源途徑噬菌體能夠?qū)⒆陨淼腄NA整合到宿主的核染色體組上，并可長期隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，因此不引起宿主細(xì)胞裂解，反而會導(dǎo)致宿主細(xì)菌表型的改變甚至增強(qiáng)細(xì)菌的致病性。鑒于噬菌體結(jié)構(gòu)簡單、寄主專一性很強(qiáng)，只能感染特定的菌種或菌株、分布廣泛、繁殖速度快的特點(diǎn)，現(xiàn)今已有很多噬菌體快速檢測食源性致病菌的方法[3]?；谑删w途徑的檢測方法，可提供方便、快速、高度特異性的選擇，特別是當(dāng)檢測費(fèi)用成為最重要的考慮因素時，更有優(yōu)勢。

2 噬菌體檢測方法

噬菌體檢測方法按照不同的原理主要可分為4種：1)傳統(tǒng)的噬菌體檢測方法是基于烈性噬菌體快速裂解宿主菌并形成直觀清晰的噬菌斑的原理，主要是噬菌體分型法和噬菌體擴(kuò)展法；2)與生物傳感器的聯(lián)用技術(shù)，如電阻抗法、電化學(xué)方法；3)采用先進(jìn)的生物或化學(xué)試劑進(jìn)行檢測工作，如生物發(fā)光法和熒光標(biāo)記法；4)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建報告噬菌體用于檢測食源性致病菌。

2.1 傳統(tǒng)的噬菌體檢測方法

烈性噬菌體能夠高度專一的裂解特異性宿主細(xì)菌，并在培養(yǎng)基上形成肉眼清晰可見的噬菌斑，根據(jù)噬菌斑的有無、多少、清晰程度、形態(tài)來判定宿主細(xì)菌的種類和數(shù)目。由此形成的噬菌體檢測方法主要包括噬菌體分型技術(shù)和噬菌體擴(kuò)增法。

2.1.1 噬菌體分型技術(shù)

細(xì)菌分型方法有血清學(xué)分型、噬菌體分型、質(zhì)粒指紋圖譜分析(P P A)、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)等[3]。噬菌體分型作為一種常用的傳統(tǒng)細(xì)菌分型方法，能夠方便的區(qū)分細(xì)菌不同血清型，在流行病學(xué)的研究中得到應(yīng)用。噬菌體分型與常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)法的檢出率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異，且相對生化實(shí)驗(yàn)可縮短時間，僅需2d[4]。研究表明，兩種或多種分型技術(shù)的聯(lián)合使用，將使分型研究向更快更準(zhǔn)的方向發(fā)展，如Grif等[5]利用5種不同的分型方法對E.coli O157進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)任何單一的分型鑒定都難以滿足流行病動力學(xué)的調(diào)查分析，多種分型方法聯(lián)合使用才能得到精確的鑒定結(jié)果。因此，盡管有更為先進(jìn)的分子分型技術(shù)手段，但操作簡單、廉價、省時的噬菌體分型技術(shù)仍是一種重要和有效的方法。

國內(nèi)外已有針對噬菌體分型方法用于致病菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)步驟，國內(nèi)《霍亂防治手冊》詳細(xì)說明了利用霍亂噬菌體分型技術(shù)鑒定細(xì)菌的方法步驟[6]。噬菌體分型時，實(shí)驗(yàn)室必須配備一整套分型所用的噬菌體以及對照株，現(xiàn)已有沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌和彎曲桿菌等食源性致病菌較為完整的噬菌體分型體系，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟可完成相應(yīng)宿主細(xì)菌的檢測工作[7-10]。但該實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果差異較大，且有些菌株尚不能用該法進(jìn)行有效分型，局限了該方法的廣泛應(yīng)用。

2.1.2 噬菌體擴(kuò)展法

烈性噬菌體感染宿主菌后短時間內(nèi)會引起細(xì)胞的裂解而在雙層平板中形成明顯的噬菌斑，因此根據(jù)噬菌斑的數(shù)目檢測樣品中病原菌的含量。但是當(dāng)樣品中的待檢細(xì)菌數(shù)目較少時，將不利于噬菌斑的形成，影響檢測結(jié)果。針對這一問題主要有兩種解決途徑：1)先使用免

疫磁性分離法(IMS)進(jìn)行待檢菌體的富集，再進(jìn)行噬菌體裂解宿主菌；2)Rees等[11]采用噬菌體擴(kuò)增法，利用輔助菌配合噬菌體對細(xì)菌的裂解以及噬菌斑的形成。

噬菌體擴(kuò)增法主要步驟如圖2所示：1)將待檢細(xì)菌的噬菌體與樣品混合，由于噬菌體高度的專一性，僅待檢細(xì)菌被噬菌體吸附侵染；2)加入滅病毒劑，滅活所有游離的噬菌體；3)中和滅病毒劑，將輔助菌加入到樣品中，并立刻混合后倒入雙層平板進(jìn)行培養(yǎng)；4)釋放出來的子代噬菌體裂解輔助菌；5)平板中形成清晰可見的噬菌斑。該方法中由于輔助菌也能夠被噬菌體裂解，因此被侵染的待檢細(xì)菌裂解釋放出來的子代噬菌體會立刻吸附裂解輔助菌從而形成清晰的噬菌斑。該方法的關(guān)鍵是選擇合適的滅病毒劑，其中化學(xué)試劑硫酸亞鐵銨(FAS)最為常用，另外植物提取物如茶提取物、番石榴提取物等也可以作為滅病毒劑[12-13]。噬菌體擴(kuò)增法簡單、檢測速度快、成本合理且檢測限較低，如Stewart等[14]利用該方法在4h內(nèi)成功檢測出樣品中的600CFU/mL的沙門氏菌以及40CFU/mL的銅綠假單胞桿菌。利用該法已成功的檢測出結(jié)核桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌和彎曲桿菌等[15-16]，但是該法的缺點(diǎn)是對檢測應(yīng)用有較高的條件選擇，如噬菌體濃度與感染時間、滅病毒劑滅活時間、輔導(dǎo)菌的篩選等。

圖2 噬菌體擴(kuò)展法檢測食源性致病菌的具體步驟Fig. 2 Specific steps for detecting foodborne pathogenic bacteria by phage-based methods

2.2 與生物傳感器技術(shù)聯(lián)用的噬菌體檢測方法

生物傳感器(biosensor)是一種獨(dú)立的、完整的分析裝置，由固定化并具有化學(xué)分子識別功能的生物材料、換能器件及信號放大裝置構(gòu)成。其工作原理是待檢測物質(zhì)與生物活性材料發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信號由換能器轉(zhuǎn)換成可定量和可處理的電信號，經(jīng)二次儀表放大輸出，最終獲得待檢物濃度的信息。將噬菌體與生物傳感器技術(shù)結(jié)合使用的主要原理是具有專一裂解特點(diǎn)的烈性噬菌體能夠?qū)⑻禺愋缘募?xì)菌裂解釋放出胞內(nèi)物質(zhì)，通過生物傳感器監(jiān)控細(xì)菌某種胞內(nèi)物質(zhì)的信號變化，檢測出致病菌。

2.2.1 應(yīng)用電阻抗法檢測食源性致病菌

電阻抗法的原理是細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，會將大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等轉(zhuǎn)化成具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化，因此可以通過檢測培養(yǎng)基的電阻抗變化情況來判定細(xì)菌的生長繁殖特性[17]。

阻抗法應(yīng)用于食品檢測操作時，首先將相應(yīng)培養(yǎng)基置于有一對不銹鋼電極的容器內(nèi)，然后接種經(jīng)過處理的樣品，在一定的溫度條件下培養(yǎng)，利用電子分析儀器檢測培養(yǎng)基中的阻抗變化，并建立阻抗變化時間與常規(guī)檢測方法之間的參數(shù)關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對微生物生長代謝的快速監(jiān)測。利用電阻抗法檢測樣品中病原菌有兩種途徑：第一種途徑使用選擇性增強(qiáng)培養(yǎng)基，僅待檢的病原菌在培養(yǎng)基中生長繁殖，其他雜菌的生長被抑制，通過觀察電阻抗的變化情況，就可得到監(jiān)測結(jié)果[18]；該方法對培養(yǎng)基要求嚴(yán)格，在實(shí)際操作過程中常會因?yàn)榕囵B(yǎng)基的選擇性不強(qiáng)造成假陽性的結(jié)果；第二種途徑利用專一性噬菌體裂解樣品中的目標(biāo)致病菌，致病菌的生長被抑制，觀察電阻抗的變化情況，判定樣品中的致病菌，該方法使得檢測的特異性和準(zhǔn)確性大大增強(qiáng)。Chang等[19]利用此法，將專一性噬菌體AR1作用于E.coil O157:H7，根據(jù)阻抗變化時間(DT)成功檢測出大腸桿菌。

同傳統(tǒng)方法相比，利用阻抗法可快速監(jiān)測食品中的微生物污染，絕大部分可在24h內(nèi)鑒定出微生物污染，而令人關(guān)注的高度污染樣品則可更早檢出；但并不是所有的細(xì)菌都能夠代謝產(chǎn)生電活性的小分子物質(zhì)，因此限制了電阻抗法的應(yīng)用。為了打破該局限，Silley等[20]通過監(jiān)測細(xì)菌代謝產(chǎn)生的CO2而不是電活性物質(zhì)檢測出樣品中的致病菌。通過改造的電阻抗法已被成功的用于葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測[21-22]。

2.2.2 應(yīng)用電化學(xué)方法檢測食源性致病菌

N e u f e l d等[23]描述了利用新型電化學(xué)方法(electrochemical method)快速鑒定和定量分析病原細(xì)菌。這個系統(tǒng)利用噬菌體對于宿主細(xì)菌的特異性，在混合的細(xì)菌菌群中專一性的裂解特異性的宿主細(xì)菌，從而釋放出該細(xì)菌的胞內(nèi)酶類，而胞內(nèi)酶類可以通過安培計測量來監(jiān)測。在模式系統(tǒng)中，利用大腸桿菌專一性的烈性噬菌體(帶有β-D-半乳糖苷酶活性作為標(biāo)記)，可以在6～8h內(nèi)檢測出1CFU/100mL的大腸桿菌。理論上，這種電化學(xué)方法可以運(yùn)用到任何噬菌體和細(xì)菌組合中，通過監(jiān)測專一性噬菌體裂解生長釋放的酶標(biāo)記，就可得到檢測結(jié)果。

與生物傳感器聯(lián)用的噬菌體檢測技術(shù)操作簡單、分析速度快，但由于生物傳感器抗干擾能力差、可靠性低，限制了生物傳感器在病原體檢測中的應(yīng)用，現(xiàn)今尚無可靠的商業(yè)化傳感器走向市場，因此影響了該噬菌

體檢測技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

2.3 采用生物或化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行噬菌體檢測

2.3.1 應(yīng)用 ATP生物發(fā)光法檢測食源性致病菌

三磷酸腺苷(ATP)是微生物不可缺少的，廣泛存在于生物體內(nèi)的一種能量物質(zhì)，能夠在真核生物luc基因編碼的螢火蟲熒光素酶的作用下發(fā)光。國外對于ATP及生物發(fā)光現(xiàn)象的研究較早，Strehler等[24]首先提出了基于ATP 的生物發(fā)光反應(yīng)機(jī)理：

一般情況下，烈性噬菌體裂解宿主菌細(xì)胞壁，將宿主菌的胞內(nèi)物質(zhì)如ATP、腺苷酸激酶(AK)等釋放出來。噬菌體介導(dǎo)的生物發(fā)光法就是利用噬菌體裂解細(xì)菌釋放出胞內(nèi)物質(zhì)ATP，使用熒光素酶可使ATP釋放出能量，這些能量產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度就代表ATP的量，從而推斷出菌落總數(shù)。1995，年Sanders[25]利用該方法檢測出樣品中的李斯特菌，但是由于食品或者環(huán)境樣品中本底ATP值的影響，導(dǎo)致檢測限較高。1998年，Blasco等[26]根據(jù)AK可催化二磷酸腺苷(ADP)轉(zhuǎn)化成ATP的原理，向樣品中加入ADP，噬菌體裂解細(xì)菌后釋放出來的AK將ADP轉(zhuǎn)化成ATP從而提高了樣品發(fā)光強(qiáng)度，能夠在1h之內(nèi)檢測出低于103CFU/mL的大腸桿菌(圖3)。利用噬菌體介導(dǎo)的ATP生物發(fā)光法能夠成功的檢測出芽孢桿菌、彎曲桿菌、大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌、沙門氏菌等[27-30]。

圖3 AK/ATP生物發(fā)光檢測法Fig.3 AK/ATP bioluminescence assay

一般ATP生物發(fā)光法檢測限為103CFU/mL，為了降低檢測限，Squirrell等[31]將噬菌體介導(dǎo)的ATP生物發(fā)光技術(shù)和IMS法聯(lián)用能夠在5min～1h內(nèi)檢測出樣品中102CFU/mL的E.coli O157。此外聯(lián)用技術(shù)還能夠同時檢測樣品中多種致病菌[32]，具有更廣泛的應(yīng)用意義。

2.3.2 采用NADH生物發(fā)光法檢測食源性致病菌

還原性輔酶酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)廣泛存在于一切動物、植物和微生物的活細(xì)胞中，是細(xì)胞能量代謝所必須的輔酶。在特定代謝時期的微生物細(xì)胞中的NADH含量是相對穩(wěn)定的，其含量與食品中微生物的數(shù)量存在成正相關(guān)性，而細(xì)菌死亡后，在胞內(nèi)酶作用下，NADH將很快被分解。由此可通過檢測NADH的含量推算出活菌數(shù)目。NADH可在FMN-NADH氧化還原酶和發(fā)光細(xì)菌lux基因編碼的熒光素酶作用下發(fā)光，生物發(fā)光機(jī)理如下：

利用噬菌體介導(dǎo)的NADH生物發(fā)光法檢測方法原理與ATP生物發(fā)光法類似，利用烈性噬菌體裂解宿主細(xì)菌，釋放出胞內(nèi)的NADH，NADH在FMN-NADH氧化還原酶和熒光素酶作用下發(fā)光，通過測定熒光強(qiáng)度，推算出菌落總數(shù)。Mei等[33]利用噬菌體介導(dǎo)的NADH生物發(fā)光法成功的檢測出克雷伯氏菌，該檢測方法操作簡單、廉價、省時。

ATP/NADH生物發(fā)光法因?yàn)闊o需培養(yǎng)，操作快速簡單，具有高靈敏度以及相對可行性(菌落總數(shù)與發(fā)光值呈顯著相關(guān))和可擴(kuò)展性(食品、食品生產(chǎn)設(shè)備和清潔設(shè)備[34]及環(huán)境樣品檢測)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于致病菌的檢測。但是該方法也有缺點(diǎn)，如需要專門的檢測儀、細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度本質(zhì)差異較大、檢測期間發(fā)光自然變化幅度較寬、重現(xiàn)性不佳、誤差較大等。

2.3.3 應(yīng)用熒光標(biāo)記噬菌體法檢測食源性致病菌

熒光標(biāo)記檢測技術(shù)是指利用熒光染料共價結(jié)合或物理吸附在某個基團(tuán)上，利用它的熒光特性來檢測病原菌的方法，因檢測快速、直觀、敏感性高而倍受青睞。常用的傳統(tǒng)熒光染料有熒光素類和羅丹明類，隨著科技的發(fā)展，由試劑公司開發(fā)的商業(yè)化熒光試劑如YOYO、SYTO、SYBR GreenI等在很大程度上代替了傳統(tǒng)的熒光染料。Goodridge等[35]報道了發(fā)展免疫親和磁分離噬菌體評估技術(shù)用以檢測大腸桿菌。通過核酸染料YOYO-1制備熒光噬菌體LG1，如圖4所示，熒光噬菌體LG1吸附至宿主菌E.coli O157:H7上，可觀察到噬菌體在細(xì)菌周圍形成光環(huán)。當(dāng)與大腸桿菌O157特異性的免疫親和磁珠結(jié)合之后，熒光噬菌體LG1就附著在磁珠上了。利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、掃描電子顯微鏡都可以檢測。該方法可以從經(jīng)過10h富集培養(yǎng)后的絞細(xì)牛肉和

鮮奶中檢測到100CFU/mL的大腸桿菌[36-37]。國內(nèi)有研究通過核酸熒光染料SYBRRgold標(biāo)記O-I噬菌體侵染沙門氏菌，熒光顯微鏡鑒定結(jié)果顯示能檢測到低于100CFU/mL的沙門氏菌[38]。

用于生物熒光標(biāo)記的發(fā)光材料越來越多，除了上述提及的商業(yè)化熒光試劑外，具有較高發(fā)光效率、巰基羧酸修飾的納米微粒，如CdSe、CdTe 等半導(dǎo)體量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)已成為科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。量子點(diǎn)具有高熒光強(qiáng)度、強(qiáng)抗光漂白能力和窄發(fā)射光譜等獨(dú)特的光學(xué)特性。與傳統(tǒng)商業(yè)化熒光試劑相比，量子點(diǎn)納米材料在光穩(wěn)定性、顏色多樣性、激發(fā)譜范圍、發(fā)色譜范圍、熒光壽命、生物相容性和儀器要求等7個方面具有優(yōu)越性。量子點(diǎn)標(biāo)記檢測法靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有較短的操作時間，且不易受樣品基質(zhì)影響的特點(diǎn)。利用QDs標(biāo)記噬菌體技術(shù)能夠成功檢測出樣品中低于10CFU/mL的大腸桿菌[39]。

熒光標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)食品中致病菌大量、快速、準(zhǔn)確而直觀的檢測，且有很強(qiáng)的優(yōu)勢，但所選用的噬菌體只能針對特定的細(xì)菌種，以致檢測目標(biāo)相對單一，且標(biāo)記染料價格昂貴，推廣應(yīng)用時受到限制。

2.4 應(yīng)用報告噬菌體法檢測食源性致病菌

圖4 熒光噬菌體LG1吸附至E.coliO157:H7Fig.4 Adsorption of fluorescent phage LG1 toE. coliO157: H7

圖5 報告噬菌體檢測方法Fig.5 Reported phage-based detection methods

目前噬菌體已被廣泛應(yīng)用于遺傳工程中的外源基因克隆和表達(dá)的載體，常用的效果最好的報告基因(rep)有細(xì)菌熒光素酶基因(lux)、綠色熒光蛋白基因(gfp)、冰核蛋白基因(ina)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。報告噬菌體檢測技術(shù)中，一個報告基因通過噬菌體插入到目標(biāo)菌體的DNA中，隨著報告基因的表達(dá)，目標(biāo)菌體便可快速得到檢測(圖5)。數(shù)據(jù)顯示，報告噬菌體已成功的用于檢測很多食源性致病菌，如沙門氏菌、大腸桿菌等(表1)。

表1 報告噬菌體的應(yīng)用Table 1 Current application of phages

2.4.1 細(xì)菌熒光素酶基因(lux)

細(xì)菌熒光素酶發(fā)光大致歷程如下：

由于報告噬菌體不具有細(xì)胞的代謝活動，無法合成發(fā)光反應(yīng)所必須的熒光素酶、底物和能量，因此噬菌體在細(xì)胞體外不發(fā)光，但是當(dāng)帶有發(fā)光基因的噬菌體吸附侵染宿主細(xì)菌后，發(fā)光基因得以表達(dá)，細(xì)菌的代謝活動產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)所必須的物質(zhì)，因此，噬菌體在宿主細(xì)胞體內(nèi)可以發(fā)光。由于噬菌體繁殖速度快，因此大大地增強(qiáng)了發(fā)光的靈敏性和速度。Waddell等[42]利用溶源性大腸桿菌噬菌體Φ v10引入luxAB基因，用于檢測E.coli O157:H7。P22噬菌體為鼠傷寒沙門氏菌噬菌體，該噬菌體引入luxAB基因后，可以在16h內(nèi)檢測出樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。

2.4.2 綠色熒光蛋白基因(gfp)

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一種生物發(fā)光蛋白，分子質(zhì)量為27kD，具有238個氨基酸，其內(nèi)源熒光基因在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時可高效發(fā)射出清晰可見的綠光，gfp基因與其他報告基因不同，處在于無需再加任何底物和輔助因子即可構(gòu)成熒光檢測系統(tǒng)。Oda等[51]報道應(yīng)用GFP標(biāo)記T2類噬菌體來檢測大腸桿菌O157:H7。這種標(biāo)記后的噬菌體不能夠與大腸桿菌K-12菌株結(jié)合，顯示該方法的特異性。

2.4.3 冰核蛋白基因(ina)

利用冰核基因報告噬菌體檢測致病菌的方法被稱作細(xì)菌冰核法。冰核基因能夠使沒有成冰核能力的細(xì)菌具有成冰核能力，這是細(xì)菌冰核法檢測的基礎(chǔ)。冰核基因與通常的報告基因不同處在于它對于信號的檢測不是由于酶的催化反應(yīng)，而是一種物理過程(水的液-固狀態(tài)的改變)。1990年，Wolber等[44]首次利用沙門氏菌噬菌體P22引入ina基因，使ina基因能夠在沙門氏菌體內(nèi)表達(dá)冰核蛋白發(fā)生冰核現(xiàn)象，通過熒光冷凍指示染料很容易檢測出樣品中的沙門氏菌，且檢出限低(10CFU/mL)。實(shí)驗(yàn)還顯示，高濃度的雜菌存在也不影響檢測結(jié)果，因此操作過程中不需要進(jìn)行目標(biāo)菌種的富集；Irwin等[52]將BIND法和IMS法聯(lián)用檢測樣品中的沙門氏菌，能夠?qū)z出限降低到5CFU/mL。

2.4.4 β-半乳糖苷酶基因(lacZ)

目前人們研究最多的編碼β-半乳糖苷酶的基因(lacZ基因)來自于E.coli。作為報告基因分子，lacZ常與熒光素酶聯(lián)用，作為lux報告基因檢測的內(nèi)參物，消除因?yàn)橘|(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率不同而帶來的誤差。Goodrigde[43]利用lacZ報告噬菌體成功檢測出樣品中的O157:H7，且檢測限僅為102CFU/mL。然后，研究人員將最大概率數(shù)(most probable number，MPN)法應(yīng)用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可降低到10CFU/mL，檢測時間僅為1h。

報告噬菌體技術(shù)耗時少、耗能低、精密度高，但目前為止這一技術(shù)還未被廣泛應(yīng)用。主要?dú)w于兩方面原因：第一，噬菌體遺傳學(xué)特性研究的不夠清晰，很難對其進(jìn)行遺傳學(xué)改造；噬菌體專一性導(dǎo)致其無法滿足檢測一個細(xì)菌中所有血清型的要求；第二，法律法規(guī)方面對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的嚴(yán)格要求也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。但是隨著生物學(xué)方面的問題不斷得到解答，科研的進(jìn)一步深入，報告噬菌體無疑將成為一種重要的病原菌檢測工具。

2.5 其他方法

Madonna等[53]將質(zhì)譜技術(shù)與噬菌體聯(lián)用檢測致病菌，先使用IMS進(jìn)行樣品中大腸桿菌的濃縮、選擇性分離，再向樣品中加入專一性噬菌體，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)方法監(jiān)控樣品中噬菌體衣殼蛋白信號的變化，從而在2h內(nèi)檢測出104CFU/mL大腸桿菌。

噬菌體檢測食源性致病菌的大部分方法都是利用噬菌體-宿主細(xì)菌之間的專一性，然而，在其他一些方法中并不是利用噬菌體而是利用內(nèi)溶素酶或噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)進(jìn)行檢測。內(nèi)溶素酶(lysin或endolysin)是由噬菌體吸附感染細(xì)菌的后期表達(dá)產(chǎn)生，能夠水解細(xì)菌的細(xì)胞壁，從而釋放出子代噬菌體。內(nèi)溶素酶能夠在體外高度裂解細(xì)菌，且同樣具有專一性[54]，因此有研究利用內(nèi)溶素酶替代噬菌體裂解細(xì)菌，結(jié)合ATP生物發(fā)光法，檢測致病菌[55]。內(nèi)溶素酶上含有識別及結(jié)合細(xì)胞壁特異位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)的專一性吸附區(qū)域(CBDs)，Kretzer等[56]構(gòu)建CBD-GFP的重組蛋白成功用于李斯特菌的檢測；噬菌體展示技術(shù)是一種用于篩選和改造功能性多肽的技術(shù)，通過將編碼多肽的基因片段與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合進(jìn)而以融合蛋白形式表達(dá)于噬菌體表面。應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)制備的高親和力配體分子或特異性抗體等常被用作探針檢測食源性致病菌[57]。

3 結(jié) 論

食品安全問題關(guān)系到人類健康和國計民生，隨著經(jīng)濟(jì)社會的不斷發(fā)展，必然會對食源性致病菌檢測提出越來越多的要求。噬菌體的檢測途徑并不單一，每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，因此在檢測工作中，科學(xué)家更傾向于將多種噬菌體檢測方法聯(lián)合使用或與其他分子生物學(xué)技術(shù)、電子傳感器技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等結(jié)合達(dá)到更靈敏，更快速，更好的檢測效果。隨著人們對噬菌體認(rèn)識的逐步深入，噬菌體在食品安全檢測中的應(yīng)用將越來越廣泛，將更能符合食源性致病菌快速檢測的需要。

[1]CHAPMAN P A, MALO A T, SIDDONS C A. Use of a commercial enzyme immunoassay and confirmation system for detection Escherichia coli O157 in bovine fecal samples[J]. Applied and Envrionmental Microbiology, 1997, 63(7): 2549-2553.

[2]HENDRIX R W. Bacteriophage genomics[J]. Current Opinion in Microbiology, 2003, 6(5): 506-511.

[3]劉均洪, 張興躍. 噬菌體在監(jiān)控和控制食源性疾病中的應(yīng)用[J]. 食品科技, 2008(7): 243-246.

[4]林國華. 用噬菌體快速診斷副溶血性弧菌及分型[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2000,16(10): 88.

[5]GRIF K, KARCH H, SCHNEIDER C, et al. Comparative study of five different techniques for epidemiological typing of Escherichia coil O157 [J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 1998, 32(3): 165-176.

[6]衛(wèi)生部疾病控制司. 霍亂防治手冊[M]. 5 版. 北京: 衛(wèi)生部疾病控制司, 1999: 31.

[7]SCHOLTENS R T. A sub-division of Salmonella typhimurium into phage types based on the method of Craigie and Yen: phages adaptable to species of the B and D group of Salmonella; phage adsorption as diagnostic aid[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1962, 28(1): 373-381.

[8]MAJTANOVA L, MAJTAN V. Phage types and virulence markers of clinical isolates of Salmonella enteritidis[J]. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2006, 55(3): 87-91.

[9]HOPKINS K L, DESAI M, FROST J A, et al. Fluorescent amplified fragment length polymorphism genotyping of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains and its relationship with host specificity, serotyping, and phage typing[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(1): 229-235.

[10]NICOLLE P, LE MINOR L, BUTTIAUX R. Phage typing of Escherichia coli isolated from cases of infantile gastroenteritis. I. Tables of the types currently classified[J]. Bulletin Academy of National Medicine, 1952, 136(24/26): 480-483.

[11]REES C E D, LOESSNER M J. Phage for the detection of pathogenic bacteria[M]//KUTTER E, SULAKVELIDZE A. Bacteriophages: Biology and Applications. Boca Raton, Florida: CRC Press, 2005: 267-284.

[12]MCNERNEY R, WILSON S M, SIDHU A M, et al. Inactivation of mycobacteriophage D29 using ferrous ammonium sulphate as a tool for the detection of viable Mycobacterium smegmatis and M. tuberculosis [J]. Research in Microbiology, 1998, 149(7): 487-495.

[13]PARK D J, DROBNIEWSKI F A, MEYER A, et al. Use of a phagebased assay for phenotypic detection of Mycobacteria directly from sputum[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(2): 680-688.

[14]STEWART G S, JASSIM S A, DENYER S P, et al. The specific and sensitive detection of bacterial pathogens within 4h using bacteriophage amplification[J]. Journal of Applied Microbiology, 1998, 84(5): 777-783.

[15]de SIQUEIRA R S, DODD C E R. REES C E D, et al. Phage amplification assay as rapid method for Salmonella detection[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 34(1): 257-263.

[16]REES C E, DODD C E R. Phage for rapid detection and control of bacterial pathogens in food[J]. Advances in Applied Microbilogy, 2006, 59: 159-186.

[17]王菊芳, 李志勇. 阻抗法及其在食品檢測中的應(yīng)用[J]. 食品檢測, 2002 (6): 49-51.

[18]EASTER M C, GIBSON D M. Rapid and automated detection of Salmonella by electrical measurements[J]. Journal of Hygiene (London), 1985, 94(3): 245-262.

[19]CHANG Tsungchain, DING H, CHEN S. A conductance method for the identification of Escherichia coli O157:H7 using bacteriophage AR1[J]. Journal of Food Protection, 2002, 65(1): 12-17.

[20]SILLEY P, FORSYTHE S. Impedance microbiology: a rapid change for microbiologists[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1996, 80(3): 233-243.

[21]BOLTON F J. An investigation of indirect conductimetry for detection of some food-borne bacteria[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1990, 69 (5): 655-661.

[22]FALAHEE M B, PARK S F, ADAMS M R. Detection and enumeration of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by indirect impedimetry with an oxygen scavenging system[J]. Journal of Food Protection, 2003, 66(9): 1724-1726.

[23]NEUFELD T, MITTELMAN A S, BUCHNER V, et al. Electrochemical phagemid assay for the specific detection of bacteria using Escherichia coil TG-1 and the M13KO7 phagemid in a model system[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(2): 652-657.

[24]STREHLER B L, McELROY W D. Factors influencing the response of the bioluminescent reaction to adenosine triphosphate[J]. Archives of Biochemistry, 1949, 22(3): 420-433.

[25]SANDERS M F. A rapid bioluminescent technique for the detection and identification of Listeria monocytogenes in the presence of Listeria innocua[M]//CAMPBELL A K, KRICKA L J, STANLEY P E. Bioluminescence and chemiluminescence: fundamental and applied aspects. New York: Wiley Press, 1995: 454-457.

[26]BLASCO R, MURPHY M J, SANDRS M F, et al. Specific assays for bacteria using phage mediated release of adenylate kinase[J]. Journal of Applied Microbiol, 1998, 84(4): 661-666.

[27]TU S I, WIJEY C, PAOLI G, et al. Detection of viable bacteria cells by bioluminescence: a bioenergetic approach[J]. Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology, 2007, 12(3): 207-219.

[28]唐倩倩, 王劍平, 蓋玲. ATP生物發(fā)光法檢測E.coli O157:H7的研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 29(2): 309-312.

[29]WU Y, BROVKO L, GRIFFITHS M W. Influence of phage population on the phage-mediated bioluminescent adenylate kinase (AK) assay for detection of bacteria[J]. Letters in Applied Microbiology, 2001, 33(4): 311-315.

[30]TETSUYA S, JUNICHI K, NOBORU T, et al. ATP amplification for ultrasensitive bioluminescence assay: detection of a single bacterial cell [J]. Bioscience Biotechology & Biochemistry, 2004, 68(6): 1216-1220.

[31]SQUIRRELL D J, PRICE R L. Rapid and specific detection of bacteria using bioluminescence[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 457(1): 109-114.

[32]HUNTER D M, LIM D V. Rapid detection and identification of bacterial pathogens by using an ATP bioluminescence immunoassay[J]. Journal of Food Protection, 2010, 73(4): 739-746.

[33]MEI Cexia, WANG Jingxue, LIN Hong. Rapid detection of Klesiella by bacterial luciferase system conmined with the bacteriophage lysis[C]// Proceeding of International Conference of Natural Produts and Traditional Medicine, Xi an, 2009, Oct 16-18, : 235-239.

[34]林玲, 陳惠, 郭廣生. 三磷酸腺苷生物發(fā)光法快速測定食品中細(xì)菌的含量[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2009, 28(7): 27-30.

[35]GOODRIDGE L, CHEN J, GRIFFITHS M. Development and characterization of a fluorescent-bacteriophage assay for detection of Escherichia coli O157:H7[J]. Applied and Environment Microbiology, 1999, 65(4): 1397-1404.

[36]MOSIER-BOSS P A, LIEBERMAN S H, ANDREWS J M, et al. Use of fluorescently labeled phage in the detection and identification of bacterial species[J]. Applied Spectroscopy, 2003, 57(9): 1138-1144.

[37]GOODRIDGE L, CHEN Jinru, GRIFFITHS M. The use of a fluorescent bacteriophage assay for detection of Escherichia coli O157:H7 in inoculated ground beef and raw milk[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 47(1/2): 43-50.

[38]蔣魯巖, 姜琴, 黃克和, 等. 用熒光標(biāo)記O2I 噬菌體快速檢測食品源沙門氏菌[J]. 微生物學(xué)報, 2009, 49(3): 372-377.

[39]EDAGR R, MCKINSTRY M, HWANG J, et al. High-sensitivity bacterial detection using biotin-tagged phage and quantum-dot nanocomplexes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2006, 103(13): 4841-4850.

[40]LOSSNER M J, RUDOLF M, SCHERER S. Evaluation of luciferase reporter bacteriophage A511: luxAB for detection of Listeria monocytogenes in contaminated foods[J]. Application Environment Microbiology, 1997, 63(8): 2961-2965.

[41]SARKIS G J, JACOBS J, WILLIAM R, et al. L5 luciferase reporter mycobacteriophage: a sensitive tool for the detection and assay of live Mycobacteria[J]. Molecular Microbiology, 1995, 15(6): 1055-1067.

[42]WADDELL T E, POPPE C. Construction of mini-Tn10luxABcam/ Ptac-ATS and its use for developing a bacteriophage that transduces bioluminescence to Escherichia coli O157:H7[J]. FEMS Microbiology Letters, 2000, 182(2): 285-289.

[43]GOODRIDGE L. Template reporter bacteriophage platform and multiple bacterial detection assays based thereon: US, 20060210968[P]. 2006-09-21.

[44]WOLBER P K, GREEN R L. Detection of bacteria by transduction of ice nucleation gens[J]. Trends Biotechnology, 1990, 8(10): 276-279.

[45]BIRMELEA M, RIPPB S, JEGIERB P, et al. Characterization and validation of a bioluminescent bioreporter for the direct detection of Escherichia coli[J]. Journal of Microbiological Methods, 2008, 75(2): 354-356.

[46]DUSTHACKEERA A, KUMARA V, SUBBIANB S. Construction and evaluation of luciferase reporter phages for the detection of active and nonreplicating Tubercle bacilli[J]. Journal of Microbiological Methods, 2008, 73(1): 18-25.

[47]SCHOFIELD D A, WESTWATER C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis[J]. Journal of Applied Microbiology,

2009, 107(5): 1468-1478.

[48]BRIGATI J R, RIPP S A, JOHNSON C M, et al. Bacteriophage-based bioluminescent bioreporter for the detection of Escherichia coli O157: H7[J]. Journal of Food Protection, 2007, 70(6): 1386-1392.

[49]THOUAND G, VACHOU P,LIU S, et al. Optimization and validation of a simple method using P22:luxAB bacteriophage for rapid detection of Salmonella enterica serotypes A, B, and D in poultry samples[J]. Journal of Food Protection, 2008, 71(2): 380-385.

[50]TANJI Y, FURUKAWA C, NA S H, et al. Escherichia coli detection by GFP-labeled lysozyme-inactivated T4 bacteriophage[J]. Journal of Biotechnology, 2004, 114(1/2): 11-20.

[51]ODA M, MORITA M, UNNO H, et al. Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 by using green fluorescent protein-labeled PP01 bacteriophage [J]. Applied of Environment Microbiology, 2004, 70(1): 527-534.

[52]IRWIN P, GEHRING A, TU S I, et al. Minimum detectable level of Salmonellae using a binomial-based bacterial ice nucleation detection assay (BIND)[J]. Journal of AOAC International, 2000, 83(5): 1087-1095.

[53]MADONNA A J, van CUYK S, VOORHEES K J. Detection of Escherichia coli using immunomagnetic separation and bacteriophage amplification coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlightmass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17 (3): 257-263.

[54]NEUFELD T, BRIAN D, RISHPON J. Combined phage typing and amperometric detection of released enzymatic activity for the specific identification and quantification of bacteria[J]. Analytical Chemistry, 2003, 75(3): 580-585.

[55]LOEFFLER M J, NELSON D, FISCHETTI V A. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wall hydrolase[J]. Science, 2001, 294(5549): 2170-2172.

[56]KRETZER J W, LEHMANN R, SCHMELCHER M, et al. High affinity cell wall binding domains of bacteriophage endolysins for immobilization and separation of bacterial cells[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(6): 1992-2000.

[57]PETRENKO V A, VODYANOY V J. Phage display for detection of biological threat agents[J]. Journal of Microbiology Methods, 2003, 53 (2): 253-262.

Research Progress of the Use of Bacteriophage to Detect Foodborne Pathogenic Bacteria

LI Meng，WANG Jing-xue*，LIN Hong
(Department of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Foodborne pathogenic bacteria have a significant impact on food safety. Traditional detection techniques are not sufficient to achieve a satisfactory detection results in short time period. Novel methods with rapidity, sensitivity and specificity are highly desired. Bacteriophages are virus-infecting bacteria, which are widespread in environment and have the characteristic of simple structure, high specificity and rapid propagation. Currently, many phage-based methods have been developed for inexpensive, fast and sensitive detection for foodborne pathogenic bacteria. In this paper, the principles and applications of phage-based methods are reviewed.

bacteriophage；pathogenic bacteria；detection method

Q939.48；TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0439-08

2010-09-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071540)

李萌(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飸?yīng)用。E-mail：mengmengli5213@126.com

*通信作者：王靜雪(1976—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飸?yīng)用。E-mail：snow@ouc.edu.cn