辣椒SRAP分子標(biāo)記的優(yōu)化及在航椒4號(hào)種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用

扈新民，李亞利，2，趙丹，高彥輝，羅愛玉，唐瑞勇，李紅民

（1.甘肅省航天育種工程技術(shù)研究中心，天水，741030；2.甘肅省天水市蔬菜產(chǎn)業(yè)開發(fā)辦公室）

辣椒SRAP分子標(biāo)記的優(yōu)化及在航椒4號(hào)種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用

扈新民1，李亞利1，2，趙丹1，高彥輝1，羅愛玉1，唐瑞勇1，李紅民1

（1.甘肅省航天育種工程技術(shù)研究中心，天水，741030；2.甘肅省天水市蔬菜產(chǎn)業(yè)開發(fā)辦公室）

為了對(duì)SRAP分子標(biāo)記在辣椒中的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L16（45），在4個(gè)水平上對(duì)影響辣椒SRAP反應(yīng)體系的Taq酶濃度、Mg2+含量、模板DNA用量、dNTP濃度及引物用量等5個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，并用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)篩選各反應(yīng)因素的最佳水平，建立了辣椒SRAP分子標(biāo)記的最佳體系。結(jié)果表明，在10 μL反應(yīng)體系中，Taq酶最適濃度為1.5 U、Mg2+最適濃度為1.5 mmol/L、模板DNA最適用量為100 ng、dNTP最適用量為0.3 mmol/L、引物最適濃度為0.1 μmol/L。利用20個(gè)辣椒材料來(lái)驗(yàn)證此反應(yīng)體系，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在350～750 bp之間多態(tài)性高，且反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。通過(guò)優(yōu)化的SRAP分子標(biāo)記對(duì)F1代辣椒種子航椒4號(hào)進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為98%，與其田間檢測(cè)結(jié)果100%十分接近。表明了SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是鑒定辣椒一代雜種純度的有效方法，具有準(zhǔn)確、可靠、快速的特點(diǎn)，在辣椒雜交種子純度室內(nèi)快速檢測(cè)中有很大的應(yīng)用前景。

辣椒；SRAP；體系優(yōu)化；正交分析法；完全隨機(jī)試驗(yàn)；純度檢測(cè)

近十幾年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展異常迅速，已相繼開發(fā)出了多種分子標(biāo)記技術(shù)，如RFLP、RAPD、SCAR、AFLP、ISSR、SRAP等[1]SRAP標(biāo)記（Sequence-Related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）是由Li等[2]開發(fā)出的一種分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記具有多態(tài)性高、信息量豐富、技術(shù)簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定和成本較低等特點(diǎn)，適用于基因定位、基因克隆、生物多樣性分析[3]、遺傳圖譜構(gòu)建[4]、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)以及比較基因組學(xué)[5]等多個(gè)研究領(lǐng)域。目前SRAP標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于水稻、蘋果、柑橘、櫻桃、大蒜、萵苣、棉花、西瓜、油菜、蓮藕、甘薯等作物的研究中[6～10]。SRAP標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的一種標(biāo)記技術(shù)，同其他標(biāo)記一樣，SRAP反應(yīng)條件受多種因素的影響，如PCR反應(yīng)中模板DNA濃度、Taq酶、引物濃度、Mg2+濃度以及dNTP的濃度等，且不同物種對(duì)反應(yīng)條件的要求也存在一定的差異。因此有必要對(duì)辣椒SRAP反應(yīng)體系中各個(gè)組分的濃度、用量以及組合效應(yīng)進(jìn)行篩選。本研究利用正交設(shè)計(jì)分析法[11]結(jié)合單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)，對(duì)PCR反應(yīng)中幾個(gè)影響試驗(yàn)結(jié)果的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以期找到最佳反應(yīng)體系。

F1代雜交種子純度直接影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此種子純度的檢測(cè)是種子質(zhì)量的關(guān)鍵。在中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GBJT3543-1995）中，種子真實(shí)性和純度是必檢項(xiàng)目。傳統(tǒng)上F1代雜種的純度主要是通過(guò)田間檢測(cè)來(lái)完成，也有一些是采用形態(tài)學(xué)鑒定法和同工酶分析法，但就種子而言，田間檢測(cè)和形態(tài)學(xué)鑒定均存在一定的缺點(diǎn)。例如田間鑒定需要的時(shí)間較長(zhǎng)，而幼苗鑒定受外界環(huán)境條件影響較大，如水分、光照、溫濕度等，觀察時(shí)，由于數(shù)量性狀較多，質(zhì)量性狀的差異比較難找，在一定程度上也影響了鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性。籽粒形態(tài)法鑒定時(shí)，因雜交種往往同其母本種子形態(tài)相似，而反交種又不易和正交種的父本種子區(qū)別，且親本同源組合種形態(tài)亦相似；另外，在種子成熟過(guò)程中，氣候、水肥等外界因素影響均可能改變種子的大小、顏色，所以形態(tài)學(xué)鑒定法難以真正鑒別大多數(shù)品種，只適合少數(shù)品種。同工酶分析法存在的主要問(wèn)題是有限酶類的分析會(huì)帶來(lái)一定的偏差，因?yàn)樗x酶的所有基因未必都表達(dá)在酶譜上，同時(shí)酶變異也未必都和形態(tài)變異有關(guān)，這就不易區(qū)別有些品種的雜交種及親本。另外，種子的發(fā)育階段或外界因素也會(huì)對(duì)酶譜分析帶來(lái)一些影響。而基于DNA基礎(chǔ)的分子標(biāo)記不受環(huán)境限制和影響、無(wú)表型效應(yīng)，具有客觀、穩(wěn)定、快速、高效等特點(diǎn)，因此分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度檢測(cè)中得到了迅速的應(yīng)用[12～14]。本試驗(yàn)就是為了優(yōu)化SRAP分子標(biāo)記反應(yīng)體系，為今后其在辣椒雜交種航椒4號(hào)進(jìn)行純度檢測(cè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的辣椒材料均取自甘肅省航天育種技術(shù)研究工程中心研發(fā)基地。2009年10月溫湯浸種后，播于溫室營(yíng)養(yǎng)缽，常規(guī)管理。用于SRAP-PCR反應(yīng)的Taq酶、dNTP、Mg2+均購(gòu)于西安鼎國(guó)生物公司，引物購(gòu)于北京三博遠(yuǎn)志公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量（Marker）DL2000購(gòu)于西安鼎國(guó)生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

①辣椒DNA的提取與濃度的測(cè)定 試驗(yàn)材料辣椒雜交種航椒4號(hào)及其父母本各育苗200株，待幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，剪取真葉，采用改良CTAB法[15]提取DNA。用Eppendorf公司生產(chǎn)的BioPhotometer核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA溶液濃度與純度，并將其稀釋為100 ng/μL，-20℃下保存待用。

②PCR反應(yīng)因素水平的初步確定與正交表的設(shè)計(jì) 為了確定PCR反應(yīng)中5個(gè)因素 （Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物）的最佳水平，初步采用正交設(shè)計(jì)L16（45），在4個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn)，共16個(gè)組合，L16（45）設(shè)計(jì)方案見表1。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，再分別進(jìn)行5個(gè)水平的單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)，逐個(gè)優(yōu)化其他反應(yīng)成分的終濃度，以確定相對(duì)較優(yōu)的因素組合。

③SRAP-PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)參照Li等[2,5]、Ferriol等[3]發(fā)表的引物序列的報(bào)道，選用上游19個(gè)引物和下游20個(gè)引物。PCR擴(kuò)增程序參照Li等[2]的方法：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；然后，再94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

④PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，160 V電壓電泳，待二甲苯氰移動(dòng)至膠板2/3處時(shí)停止，銀染顯色。最后在凝膠迷你成像系統(tǒng)中照相并記錄分析。

⑤SRAP最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證 利用20個(gè)辣椒品種對(duì)優(yōu)化確定的辣椒SRAP-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。

⑥航椒4號(hào)辣椒雜交F1代純度的檢測(cè) 利用所優(yōu)化的辣椒SRAP-PCR體系對(duì)辣椒品種航椒4號(hào)雜種一代進(jìn)行純度檢測(cè)。

表1 PCR反應(yīng)正交試驗(yàn)L16（45）設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 利用正交設(shè)計(jì)和完全隨機(jī)試驗(yàn)優(yōu)化辣椒SRAP反應(yīng)體系

①正交設(shè)計(jì)分析確定辣椒SRAP反應(yīng)體系的關(guān)鍵影響因素 按表1設(shè)計(jì)的16個(gè)處理進(jìn)行PCR反應(yīng)后，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1。從圖1中可以直觀看出，在16個(gè)處理組合中由于Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物5個(gè)因素濃度組合的不同，擴(kuò)增的效果存在明顯差異。處理1，6，11模板DNA濃度過(guò)低，擴(kuò)增產(chǎn)物模糊、帶微弱，不易觀察。處理4，9，15的dNTP濃度高與游離Mg2+結(jié)合對(duì)PCR有抑制作用，背景色深，帶形彌散并有拖帶現(xiàn)象。處理3，12，16的Mg2+和dNTP濃度均高，背景色深，不易觀察。綜合考慮各因素，處理10擴(kuò)增的條帶清晰，航椒4號(hào)的父本和母本都得到很好的擴(kuò)增結(jié)果，為最佳組合。即在10 μL的反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物的濃度分別為1.5 U，1.5 mmol/L，100 ng，0.3 mmol/L，0.1 μmol/L。

②Mg2+濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響 利用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)，以引物Em18OD3研究辣椒PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度（0.5～2.5 mmol/L）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。當(dāng)一種PCR組分進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，其他組分濃度不變。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，在Taq酶為1.0 U反應(yīng)體系中，Mg2+濃度為0.5，1.0 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶弱；濃度為1.5～2.0 mmol/L時(shí)條帶比較清晰，但濃度為1.5 mmol/L時(shí)最清晰，擴(kuò)增效果最好；當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí)擴(kuò)增的特異性降低，條帶彌散。確定 Mg2+的最終濃度為1.5 mmol/L。

圖1 辣椒SRAP-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果

圖2 辣椒Mg2+濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響

圖3 辣椒模板DNA用量對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響

圖4 dNTP濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響

圖5 Taq酶濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響

圖6 引物濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響

③DNA濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響 利用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)，以EM18OD3為引物，研究辣椒PCR反應(yīng)體系中模板DNA（50～250 ng）濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。結(jié)果如圖3所示，在Taq酶為1.5 U反應(yīng)體系中，DNA在100～200 ng均能產(chǎn)生清晰的條帶，所以DNA終濃度選為100 ng。

④dNTP濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響 擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，dNTP濃度為0.1 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出來(lái)的條帶較淺，當(dāng)dNTP濃度大于0.3 mmol/L時(shí)，由于dNTP能與游離Mg2+結(jié)合，降低了Mg2+濃度，從而影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使擴(kuò)增條帶亮度變?nèi)酢Ｋ詃NTP濃度在0.2～0.3 mmol/L擴(kuò)增效果最佳。

⑤Taq酶濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響 擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，當(dāng) Taq酶濃度為0.5 U和1.0 U時(shí)，擴(kuò)增出來(lái)的條帶較弱且條帶較少，當(dāng)濃度超過(guò)2.0 U時(shí)擴(kuò)增出來(lái)的條帶較模糊不夠清晰，Taq酶濃度為1.5 U時(shí)出現(xiàn)明亮清晰的條帶，所以Taq酶最適濃度為1.5 U。

⑥引物濃度對(duì)辣椒SRAP標(biāo)記的影響 擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，當(dāng)引物濃度在0.1～0.3 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增的效果較好；當(dāng)引物濃度在0.4～0.5 μmol/L時(shí)，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，所以最佳引物濃度在0.1～0.3 μmol/L。

2.2 最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，運(yùn)用兩對(duì)不同引物對(duì)10份辣椒DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，結(jié)果如圖7所示。引物對(duì)每份DNA樣品均擴(kuò)增出清晰的條帶，說(shuō)明該體系穩(wěn)定，為辣椒SRAP分子標(biāo)記最佳反應(yīng)體系。

2.3 F1雜交種純度的檢測(cè)

從本次純度檢測(cè)SRAP分子標(biāo)記電泳結(jié)果中，我們得到3種結(jié)果，也就是說(shuō)引物通過(guò)擴(kuò)增出現(xiàn)3類情況：第一類，對(duì)其親本F1代擴(kuò)增沒(méi)有差異條帶；第二類，偏母本型，F(xiàn)1代與母本有共有帶，與父本沒(méi)有；第三類，偏父本型，F(xiàn)1代與父本有共有帶，與母本沒(méi)有。在這3類結(jié)果中，第一類不能用于F1代雜種純度鑒定，只有把偏父本型與偏母本型結(jié)合使用才能準(zhǔn)確鑒別F1代雜交種的純度[17，18]。對(duì)33株辣椒品種航椒4號(hào)進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記純度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)32株有父母本的特異條帶，其純度為98%（圖8，9）。與田間對(duì)其航椒4號(hào)辣椒的純度進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查驗(yàn)證結(jié)果為100%非常接近，證明了SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是鑒定辣椒一代雜種純度的有效方法，具有準(zhǔn)確、可靠、快速的特點(diǎn)，在辣椒雜交種子純度室內(nèi)快速檢測(cè)中有很大的應(yīng)用前景。

圖7 最佳反應(yīng)體系對(duì)10份辣椒品種的聚丙烯酰胺擴(kuò)增結(jié)果

圖8 F1雜交種純度的檢測(cè)（偏母本型）

圖9 F1雜交種純度的檢測(cè)（偏父本型）

3 結(jié)論與討論

本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)對(duì)辣椒SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。在PCR反應(yīng)體系中各個(gè)因素間互相都產(chǎn)生作用，Taq酶受Mg2+濃度的影響，而Mg2+的最終反應(yīng)濃度主要受到dNTP的影響，當(dāng)dNTP濃度過(guò)高時(shí)游離Mg2+被吸附從而使Mg2+濃度降低。本試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的方法可以綜合考慮觀察各個(gè)因素間的互相作用，再結(jié)合較少因素的完全隨機(jī)試驗(yàn)可逐步篩選其他成分的最佳濃度水平。通過(guò)篩選得到最佳反應(yīng)體系為：10 μL體系中，模板DNA 100 ng、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L，引物0.1 μmol/L，Taq酶1.5 U。

利用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行種子純度的鑒定已經(jīng)在花生[19]、西瓜[20，21]等作物中應(yīng)用，但在辣椒種子純度鑒定中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用SRAP分子標(biāo)記檢測(cè)雜交種子航椒4號(hào)辣椒種子純度為98%，與其田間農(nóng)藝性狀的檢測(cè)結(jié)果100%非常接近，所以通過(guò)本次試驗(yàn)充分說(shuō)明利用SRAP分子標(biāo)記可以在DNA水平上檢測(cè)辣椒種子純度，還可運(yùn)用于辣椒分子標(biāo)記輔助育種，從而提高育種的效率，加快育種進(jìn)程，促進(jìn)辣椒育種工作的發(fā)展。

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Optimization of SRAP Marker in Pepper and Its Application in Purity Testing of Hangjiao No.4 Seeds

HU Xinmin1,LI Yali1,2,ZHAO Dan1,GAO Yanhui1,LUO Aiyu1,TANG Ruiyong1,LI Hongmin1
(1.Space Breeding Engineering Research Center of Gansu Province,Tianshui 741030; 2.Vegetable Industry Development Office of Tianshui)

The experiment was conducted to investigate the impact of Taq enzyme concentration,Mg2+content,amount of template DNA,concentration of dNTP and amount of primer on SRAP reaction system for pepper by using ofL16(45)orthogonal design.The fully random single factor experiment design was used to select the optimum level for each factor to optimize the SRAP amplification system.The results showed that in the 10 μL reaction system,the optimum concentration of Taq enzyme,Mg2+,template DNA,dNTP and primers are 1.5 U,1.5 mmol/L,100 ng,0.3 mmol/L and 0.1 μmol/L,respectively.The established amplification system was tested on 20 pepper strains and 6%denaturing polyacrylamide gel electrophoresis results showed that the amplified products were in the range of 350-750 bp polymorphism,and the reaction system was proved in good stability and reproducibility.Using the optimized SRAP markers to test seeds of Hangjiao No.4,the results was 98%,and the purities were very close to the purities field tested 100%,which indicated that SRAP markers would have a wide range of application in rapid lab test of seed purities of watermelon hybrid cultivars.

Pepper;SRAP markers;Optimization system;Orthogonal design analysis; Completely ran-domized design; Purity Testing

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.003

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2008BAD97B06-2），甘肅省科技孵化器項(xiàng)目（094TTPA0016）

扈新民（1982-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟擞N與生物技術(shù)，E-mail：hxm821219@126.com

李亞利，通信作者，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟擞N與生物技術(shù)，E-mail：chairsh@126.com

2010-06-30