超高效液相色譜測(cè)定蜂蜜及其制品中的苯甲酸、山梨酸

黃京平，李 熠，周金慧，吳黎明，陳蘭珍，趙 靜，薛曉鋒,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2. 農(nóng)業(yè)部國(guó)家蜂產(chǎn)品加工專(zhuān)業(yè)分中心，北京 100093)

超高效液相色譜測(cè)定蜂蜜及其制品中的苯甲酸、山梨酸

黃京平1,2，李 熠1,2，周金慧1,2，吳黎明1,2，陳蘭珍1,2，趙 靜1,2，薛曉鋒1,2,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2. 農(nóng)業(yè)部國(guó)家蜂產(chǎn)品加工專(zhuān)業(yè)分中心，北京 100093)

研究蜂蜜及其制品中的山梨酸與苯甲酸兩種防腐劑的提取凈化及其超高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品用水溶解，超聲波輔助提取樣品中的山梨酸與苯甲酸。樣液經(jīng)高速離心，濾膜過(guò)濾后，采用超高效液相色譜梯度洗脫與二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定樣品中的山梨酸與苯甲酸的含量。以BEH Shield RP18(2.1mm×100mm，1.7μm)為色譜柱，以0.02mol/L乙酸銨溶液和乙醇為流動(dòng)相梯度洗脫，兩種防腐劑在4min中內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的分離。方法檢出限：苯甲酸為2.5mg/kg，山梨酸為2.0mg/kg。以加標(biāo)樣品做添加回收率測(cè)定，苯甲酸與山梨酸的回收率分別為94.1%～102.3%和96.2%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。方法簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高，是一種較好的定性和定量方法。

蜂蜜；蜂蜜制品；苯甲酸；山梨酸；超高效液相色譜

苯甲酸和山梨酸是目前食品加工業(yè)最常使用的兩種食品防腐劑，被廣泛用于各類(lèi)食品中。食用含有過(guò)量苯甲酸和山梨酸的食品會(huì)影響人體對(duì)維生素和鈣的吸收，加重人的肝臟負(fù)擔(dān)，并引起毒性反應(yīng)或誘發(fā)癌癥[1]。FAO與WHO詳細(xì)規(guī)定了不同食品中苯甲酸與山梨酸的使用范圍與用量，我國(guó)也對(duì)防腐劑的使用有著嚴(yán)格規(guī)定，國(guó)家食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》)規(guī)定了各類(lèi)食品中苯甲酸與山梨酸的使用限量。一些國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法也已頒布，用于監(jiān)控食品中苯甲酸和山梨酸的不合理使用。比如，GB/T 5009.9—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定》[2]；GB/ T 23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定：高效液相色譜法》[3]；GB 21703—2010《乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定》[4]。

近些年來(lái)，受利益驅(qū)使，有些不法企業(yè)用一些果葡糖漿，人工色素(日落黃)，防腐劑(苯甲酸、山梨酸)等做成假蜂蜜以天然蜂蜜或制品投入市場(chǎng)，牟取暴利，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的權(quán)益。GB 18796—2005《蜂蜜》強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定蜂蜜：“不得添加或混入任何防腐劑、澄清劑、增稠劑等異物[5]”。盡管一些防腐劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法已經(jīng)頒布，但這些標(biāo)準(zhǔn)主要用于醬油、蔬菜、奶制品中的苯甲酸與山梨酸的測(cè)定，還沒(méi)有相關(guān)蜂蜜產(chǎn)品及其制品(蜜膏、蜜乳)中山梨酸與苯甲酸的檢測(cè)方法。建立一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的蜂蜜及其制品中的苯甲酸與山梨酸的檢測(cè)方法，對(duì)于保護(hù)人民身體健康，完善現(xiàn)有蜂蜜質(zhì)量與安全檢測(cè)方法體系，促進(jìn)養(yǎng)蜂業(yè)快速健康發(fā)展有著重要意義。

苯甲酸和山梨酸的分析方法主要有紫外分光光度法[2,6]、氣相色譜法[2,7-8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、高效液相色譜法[2-4,11-15]，其中，高效液相色譜法是最常用的方法。近些年，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，在食品分析中，盡量減少使用有毒試劑，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康，保護(hù)自然生態(tài)環(huán)境已成為分析檢測(cè)技術(shù)的重要趨勢(shì)之一，人們將這種檢測(cè)技術(shù)稱(chēng)之為環(huán)境友好的分析方法或綠色分析方法[16]。本實(shí)驗(yàn)在樣品的提取和分析過(guò)程中，使用無(wú)毒和低毒試劑，建立一種使用8 0℃水浴提取與超高效液相色譜(UPLC)快速測(cè)定蜂蜜及其制品中的苯甲酸和山梨酸的方法，并分析一些實(shí)際樣品，調(diào)查這些樣品中兩種防腐劑的使用情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然蜂蜜 云南羅平與浙江平湖種蜂場(chǎng)；蜂蜜制品各地市場(chǎng)抽樣。

苯甲酸與山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；無(wú)水乙醇和乙酸銨為色譜純 Baker公司。

0.02 mol/L乙酸銨溶液：稱(chēng)取0.77g乙酸銨，用純水溶解，定容至500mL容量瓶中，使用前用0.2μm濾膜過(guò)濾。苯甲酸與山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/mL)：稱(chēng)取適量苯甲酸與山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇配制成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，根據(jù)需要用純水配制成適合質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜儀(配有PDA檢測(cè)器)、2K-15高速離心機(jī)、微孔濾膜(0.22μm) Waters公司；DK600A恒溫水浴 上海精密儀器公司；KQ218超聲波江蘇昆山舒美公司；Q-POD超純水器 密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱(chēng)取5g樣品到50mL容量瓶中，加入35mL水，混勻1min，在80℃水浴10min后，用超聲波超聲提取10min，將溶液放置室溫，用純水定容至50mL，取出5mL置于離心管中12000r/min離心5min，取上清液，用0.22μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters BEH Shield RP18(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相：0.02mol/L乙酸銨溶液(A)和乙醇(B)；流速：0.40mL/min，梯度洗脫程序?yàn)?～1.2min，95% A；1.2～2.2min，60% A；2.2～4.0min，95% A；柱溫：45℃；進(jìn)針體積：4μL；檢測(cè)器：全波長(zhǎng)掃描，210～400nm，提取波長(zhǎng)：230nm；以保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液及沉淀方法的選擇

常用提取苯甲酸與山梨酸的試劑有甲醇溶液、乙醚、鹽酸溶液、氨水和氫氧化鈉溶液等，其中，鹽酸溶液與乙醚的提取主要用于氣相色譜分析。甲醇溶液、氨水和氫氧化鈉溶液用于反相高效液相色譜分析。在樣品提取過(guò)程中，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液是常用的蛋白沉淀試劑，這兩種試劑均可以很好地沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，降低在測(cè)定苯甲酸與山梨酸過(guò)程中的基質(zhì)干擾。這些提取和凈化方法均能很好地用于分析樣品中的苯甲酸和山梨酸，但這些方法在提取過(guò)程中用到酸、有機(jī)溶劑、重金屬鹽等，容易污染環(huán)境，同時(shí)對(duì)操作人員的健康也產(chǎn)生一定的影響。在本研究中，選擇水作為提取試劑，超聲波輔助下提取蜂蜜及其制品中的苯甲酸和山梨酸，通過(guò)水浴與高速離心沉淀樣品中的蛋白，方法可以有效地去除蜂蜜及制品中的蛋白及其他雜質(zhì)，且能保證兩種防腐劑的提取回收率在90%以上。

2.2 超高效液相色譜條件的選擇

2.2.1 分離條件的選擇

用反相液相色譜分離苯甲酸和山梨酸時(shí)，通常使用C18色譜柱，用磷酸鹽或乙酸銨鹽溶液與甲醇或乙腈作為流動(dòng)相等度洗脫分離，用紫外或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)分析[2-4,11-15]。在本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇與0.02mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫分離苯甲酸和山梨酸，相比報(bào)道的分離方法，該方法快速、簡(jiǎn)單，可以有效地將樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)物分離，同時(shí)，乙醇、甲醇和乙腈相比，乙醇毒性小，對(duì)環(huán)境和操作人員的危害小。標(biāo)樣和實(shí)際樣品分離色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 苯甲酸與山梨酸標(biāo)樣(A)與實(shí)際樣品(B)測(cè)定色譜Fig.1 Chromatograms of benzoic acid and sorbic acid standards

2.2.2 波長(zhǎng)的選擇

圖2 苯甲酸(A)與山梨酸標(biāo)樣(B)紫外光譜圖Fig.2 UV-spectra of benzoic acid and sorbic acid standards

圖3 待測(cè)樣品中苯甲酸的紫外光譜圖Fig.3 UV-spectra of benzoic acid and sorbic acid in samples

在上述的色譜分析條件下，通過(guò)在210～400nm范圍進(jìn)行掃描，苯甲酸的最佳吸收波長(zhǎng)在223.8nm，山梨酸在254.3nm；文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，在這個(gè)波長(zhǎng)下，兩種防腐劑都有很好的響應(yīng)，且基線(xiàn)穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇230nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，用兩種防腐劑在210～400nm的紫外光吸收譜圖作為定性分析的依據(jù)。兩種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)際樣品分析光譜圖如圖2、3所示。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

用苯甲酸與山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量4μL，用峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作圖，苯甲酸線(xiàn)性方程為Y=38023X＋6480.2，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.9997；山梨酸性方程為Y=54497X＋4051.8，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.9998。按照3倍信噪比計(jì)算，方法檢出限：苯甲酸2.5mg/kg，山梨酸2.0mg/kg。2.4回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

表1 苯甲酸和山梨酸的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table1 Recovery rates and RSD of benzoic acid and sorbic acid in spiked samples (n=5)

在空白樣品上作10、20、50mg/kg添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)測(cè)定重復(fù)5次，測(cè)定的平均回收率及精密度見(jiàn)表1。在10～50mg/kg添加量范圍內(nèi)回收率，苯甲酸與山梨酸的回收率分別為94.1%～102.3%和96.2%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，能夠滿(mǎn)足日常蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的分析。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法測(cè)定一些來(lái)自蜂場(chǎng)與市場(chǎng)的蜂蜜及其制品樣品中的苯甲酸和山梨酸的含量，調(diào)查蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的添加情況。在分析的56份樣品中，天然蜂蜜樣品中均未檢出苯甲酸與山梨酸，在一份蜂蜜制品(蜜膏)中檢出苯甲酸，含量為56.4mg/kg。通過(guò)光譜與保留時(shí)間確認(rèn)為苯甲酸。實(shí)際樣品圖見(jiàn)圖1B和圖3。蜂蜜國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)雖然規(guī)定了蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以用這些標(biāo)準(zhǔn)判定蜂蜜產(chǎn)品是否合格，但對(duì)于蜂蜜制品，如蜜乳或蜜膏，因?yàn)闆](méi)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，則無(wú)法對(duì)其質(zhì)量與安全進(jìn)行有效監(jiān)管。從蜂蜜制品中檢出苯甲酸，說(shuō)明蜂蜜制品存在一定的安全隱患，蜂蜜制品的質(zhì)量與安全應(yīng)該引起國(guó)家食品質(zhì)量與安全管理部門(mén)的重視。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高且環(huán)境友好的超高效液相色譜測(cè)定蜂蜜及其制品中苯甲酸與山梨酸的方法。方法適用于測(cè)定蜂蜜及其制品中的苯甲酸與山梨酸。將該方法用于測(cè)定實(shí)際樣品，調(diào)查苯甲酸和山梨酸在實(shí)際樣品中的添加情況。

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[4]GB 21703—2010 乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定[S].

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Determination of Benzoic Acid and Sorbic Acid in Honey and Honey Products by Ultra-performance Liquid Chromatography

HUANG Jing-ping1,2，LI Yi1,2，ZHOU Jin-hui1,2，WU Li-ming1,2，CHEN Lan-zhen1,2，ZHAO Jing1,2，XUE Xiao-feng1,2,*
(1. Institute of Apiculture Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. National Research Center of Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100093, China)

In this article, extraction, clean-up and ultra-performance liquid chromatographic analysis of benzoic acid and sorbic acid in honey and honey products were investigated. The samples were dissolved in water first. Benzoic acid and sorbic acid were extracted by an ultrasonic method. After clean up processing with high-speed centrifugation and filtration, the extract was determined by an ultra-performance liquid chromatography with PDA detector. A gradient separation was achieved within 4 min using BEH Shield RP18column (2.1 mm ×100 mm, 1.7 μm) with ammonium acetate and ethanol as a mobile phase. The developed method was a simple, fast and sensitive. The limit of detection for benzoic acid and sorbic acid were 2.5 mg/kg and 2.0 mg/kg, respectively. The recovery rates of spiked benzoic acid and sorbic acid were 94.1%－102.3% and 96.2%－99.8%, respectively. The relative standard deviations were less than 5%. This method has been successfully applied to analyze some real samples from beekeeper and market for investigating the distribution of benzoic acid and sorbic acid in honey and honey products.

honey；honey product；benzoic acid；sorbic acid；ultra-performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0417-04

2010-05-12

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(峰)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(NYCYTX-43)

黃京平(1983—)，男，實(shí)習(xí)研究員，本科，主要從事蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全分析研究。E-mail：huang8210759@126.com

*通信作者：薛曉鋒(1979—)，男，助理研究員，博士研究生，主要從事蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全分析研究。E-mail：xue_xiaofeng@126.com