Western斑點(diǎn)印跡法檢測致病性副溶血弧菌

楊靖亞，張 建，趙 勇，陶 妍，陸小凡，晁若瑜

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

Western斑點(diǎn)印跡法檢測致病性副溶血弧菌

楊靖亞，張 建，趙 勇，陶 妍，陸小凡，晁若瑜

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

目的：對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)的直接耐熱溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)進(jìn)行分離純化，建立Western斑點(diǎn)印跡法技術(shù)檢測致病性副溶血弧菌的方法。方法：用直接耐熱溶血毒素免疫小鼠得到特異性抗血清，利用棋盤方法確定免疫血清最佳工作濃度，并對致病性與非致病性副溶血弧菌分別進(jìn)行特異性測定。結(jié)果：最佳免疫血清最佳工作濃度為1:3200；檢測致病性副溶血弧菌為陽性，非致病性副溶血弧菌屬呈陰性。結(jié)論：Western斑點(diǎn)印跡法技術(shù)可以特異性檢測致病性副溶血弧菌，靈敏度高、操作簡單，可用肉眼判定結(jié)果。

耐熱直接溶血毒素；Western斑點(diǎn)印跡；致病性副溶血弧菌；檢測

副溶血弧菌是一種嗜鹽性細(xì)菌，屬弧菌科、弧菌屬。存在于近海岸的海水和魚類、貝類中，具有致病性的菌株可引起食物中毒或腹瀉，是我國沿海地區(qū)重要的食源性致病菌。它的致病性作用在于可以產(chǎn)生多種溶血毒素，它們是耐熱溶血毒素(thermostable direc themolysin，TDH)、耐熱溶血毒素相關(guān)溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)[1]。而流行病學(xué)研究表明，臨床上分離出的致病性副溶血弧菌中95%都含有TDH，即神奈川(kangawa phenomenon，KP)陽性，而環(huán)境株則絕大多數(shù)為KP陰性[2]。目前，副溶血弧菌的檢測手段主要有分離培養(yǎng)技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)、免疫學(xué)方法等[3]。常規(guī)的分離培養(yǎng)操作繁瑣、周期較長、檢出率較低；PCR方法雖然具有特異、敏感等特點(diǎn)，但其程序復(fù)雜，需要精密儀器與設(shè)備，不利于推廣應(yīng)用[4-7]；其中免疫學(xué)方法應(yīng)用最多的是ELISA技術(shù)[8]。本研究擬利用副溶血弧菌的主要致病因子TDH作為抗原，制作特異性免疫血清作為抗體，并在此基礎(chǔ)上利用Western 斑點(diǎn)印跡法技術(shù)檢測致病性副溶血弧菌。因此在檢測過程中只會(huì)對分泌TDH的致病性副溶血弧菌敏感，而對環(huán)境中非致病性副溶血弧菌不敏感、特異性更強(qiáng)、操作簡單，試為致病性副溶血弧菌的檢測提供一種簡單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

日本大耳兔 上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；Balb/c小鼠 上海西普爾-必凱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。致病性副溶血弧菌ATCC 33846(標(biāo)準(zhǔn)菌株) 中國科學(xué)院生物研究所；非致病性副溶血弧菌F188(從南美白對蝦分離出，只含TLH不含TDH，通過生理生化試驗(yàn)和PCR分析，確定為非致病性副溶血弧菌)由上海海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、OPD、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 上海Sigma貿(mào)易有限公司；硝酸纖維素(NC)膜 Wolkman公司；牛血清蛋白(BSA) 上海日初生物公司。

恒溫培養(yǎng)箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；真空泵上海滬西儀器分析廠有限公司；孔板振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；680型酶標(biāo)儀 BioRad公司。

1.2 抗原TDH的制備

1.2.1 TDH的提取與純化

37℃條件下對致病性副溶血弧菌ATCC 33846進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)16h，8000r/min離心去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經(jīng)過DEAE-纖維素、DEAESephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH[9-10]，冷凍干燥純化后的TDH，準(zhǔn)確稱量，溶解于少量pH7.4 0.01mol/L的PBS中。

1.2.2 TDH溶血活性及耐熱性的測定

靜脈取新鮮兔血0.43mL與20.0mL的PBS(+)混合制作紅細(xì)胞懸液。在V形96孔板上每空加入100μL紅細(xì)胞懸液，20μL純化后的TDH，放入恒溫培養(yǎng)箱在37℃條件下培養(yǎng)24h，觀察溶血現(xiàn)象，底部沒有紅細(xì)胞即產(chǎn)生了溶血。同時(shí)，將少量TDH水浴100℃加熱10min，然后用同樣方法測定加熱后的TDH是否還具有溶血活性，判斷純化后的TDH的耐熱性。

1.2.3 TDH變性溫度與純度的測定

利用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)來測量TDH的變性溫度與純度；加樣量為4.5000mg，溫度設(shè)定范圍為25～125℃，時(shí)間為10min[11]。

1.3 特異性抗TDH免疫血清的制備

1.3.1 免疫動(dòng)物

同時(shí)免疫4只8周齡雄性Balb/c小鼠，取純化后的TDH 10μg與福氏完全佐劑充分混合乳化首次免疫，分別3周后取5μg TDH與福氏不完全佐劑混合乳化2次、3次免疫小鼠。

1.3.2 抗血清的效價(jià)測定與抗血清的制作

最后一次免疫3d之后間接ELISA方法測其效價(jià)，選擇效價(jià)在1:10000以上的小鼠斷尾取血，與室溫條件下放置1h，之后放于4℃冰箱中靜止4h，3000r/min離心10min用移液器將血清吸出，分裝于無色聚丙烯冷凍管中，放于－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 使用Western斑點(diǎn)印跡法檢測致病性副溶血弧菌操作程序

1.4.1 硝酸纖維素膜的預(yù)處理

剪取適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜，在蒸餾水中浸泡15min，取出后甩干，于37℃條件下干燥15min。再以轉(zhuǎn)移緩沖液(40mmol/L Tris-HCl、0. 037%十二烷基磺酸鈉(SDS)、20%甲醇、39mmol/L甘油) 浸泡30min以上，濾紙同步處理，用直徑4～6mm的打孔器于膜的麻面間隔壓印[12]。

1.4.2 點(diǎn)樣

將濾紙和膜放于點(diǎn)樣器上, 膜在濾紙上面，依次加入待測樣品，每孔10μL負(fù)壓抽干。

1.4.3 封閉

將已點(diǎn)樣的膜浸入含5% BSA的封閉液中, 于37℃條件下孵育60min，期間搖動(dòng)3～4次。取出后用PBST (0.01mol/L，pH7.4，含體積分?jǐn)?shù)0.05%的Tween-20)漂洗3次，每次3min，每次洗滌中間搖動(dòng)數(shù)次。

1.4.4 與血清抗體

將膜浸入工作濃度的特異性抗血清血清，于37℃條件下孵育60min，期間搖動(dòng)3～4次。取出后用PBST漂洗3次，每次3min。

1.4.5 酶標(biāo)抗體作用

將膜浸入兔抗鼠IgG酶標(biāo)抗體溶液(1:3000稀釋)中于37℃條件下孵育60min，期間搖動(dòng)3～4次。取出后用PBST漂洗3次，每次3min。

1.4.6 顯色

迅速將新配制好的OPD底物液滴加在膜上，盡量封閉于壓印環(huán)內(nèi)，每環(huán)約10μL，輕輕振搖，于室溫條件下避光顯色20min，每膜滴加5μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

1.4.7 記錄結(jié)果

用冷的蒸餾水洗滌顯色后的NC膜，快速照相，最后用錫箔紙密封保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 抗體最佳工作濃度的確定

用封閉液將免疫血清從1:400(V/V，下同)遞倍稀釋到1:12800，進(jìn)行棋盤實(shí)驗(yàn)，吸附在NC膜上的抗原均為純化后的TDH，其他條件保持不變。

1.6 TDH免疫血清對致病性副溶血弧菌的特異性實(shí)驗(yàn)

分別對副溶血弧菌ATCC 33846與副溶血弧菌F188進(jìn)行進(jìn)行液體搖床擴(kuò)大培養(yǎng)15h，離心去掉菌體取上清作為待測樣品。同時(shí)設(shè)立陽性對照、陰性血清對照及空白對照(細(xì)菌培養(yǎng)基)，前兩者的吸附抗原為純化后的TDH，陽性對照、空白對照及兩種待測樣品的抗血清均為小鼠特異性抗TDH免疫血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原TDH的制作

2.1.1 TDH溶血活性及耐熱性的測定

純化后的T D H對兔紅細(xì)胞懸液具有敏感的溶血活性，水浴100℃加熱10min后仍保持溶血活性(圖1)。

圖1 溶血活性及耐熱性的測定Fig. 1 Determination of hemolysin activity and heat resistance

2.1.2 TDH的純度與變性溫度

本次實(shí)驗(yàn)首次引用DSC方法來檢測TDH的純度與變性溫度，整條曲線只有一個(gè)波峰，結(jié)果表明，經(jīng)過3次層析后的TDH的純度較高，并且測得TDH的變性溫度為94.17℃(圖2)。

圖2 TDH的DSC曲線Fig.2 Differential scanning calorimetry curve of TDH

2.2 特異性抗TDH的免疫血清制作

2.2.1 動(dòng)物免疫

本實(shí)驗(yàn)中的TDH具有溶血活性和致死性，因此，免疫小鼠的抗原劑量要嚴(yán)格控制，否則會(huì)致死小鼠，同時(shí)免疫間隔周期為3周，周期過短也會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。

2.2.2 效價(jià)測定

由于TDH的分子質(zhì)量為46kD的蛋白質(zhì)[13]，因此具有較強(qiáng)的免疫原性，4只小鼠都產(chǎn)生了較好的血清抗體效價(jià)(表1)。

表1 間接ELISA測定4只小鼠的抗體效價(jià)結(jié)果Table1 Antibody titer determined by indirect ELISA

2.3 最佳工作濃度的確定

根據(jù)棋盤原理，從試驗(yàn)結(jié)果中選出斑點(diǎn)顯色清晰、深淺適宜的抗體稀釋度作為最佳工作濃度。經(jīng)測定，特異性抗血清的最佳工作濃度為1:3200(圖3)。

圖3 抗體最佳工作濃度的確定Fig.3 Determination of optimal working concentration for antibodies

2.4 對致病性副溶血弧菌與非致病性副溶血弧菌的敏感性

圖4 Western斑點(diǎn)印跡檢測致病性副溶血弧菌Fig.4 Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticu by Western blotting

圖5 Western斑點(diǎn)印跡檢測非致病性副溶血弧菌Fig.5 Detection of non-pathogenic Vibrio parahaemolyticu by Western blotting

由于本實(shí)驗(yàn)中制備的小鼠血清是特異性抗TDH免疫血清，只對致病性副溶血弧菌敏感，而對非致病性副溶血弧菌不敏感。從圖4看到，當(dāng)檢測致病性副溶血弧菌的培養(yǎng)菌液時(shí)，由于在NC膜上吸附著TDH，因此在NC膜上顯色最后呈現(xiàn)明顯的橘紅色的斑點(diǎn)；而非致病性副溶血弧菌的菌液、空白對照及陰性血清在膜上無明顯斑點(diǎn)，顯示陰性(圖5)。

3 討 論

目前應(yīng)用在檢測副溶血弧菌免疫學(xué)的方法主要是用菌體本身做抗原免疫動(dòng)物，得到多克隆抗體，而且在免疫動(dòng)物之前需要對副溶血弧菌進(jìn)行滅活制作免疫苗[14]。而本實(shí)驗(yàn)利用多種層析提取純化副溶血弧菌的主要致病毒素TDH，將純化后的具有活性的TDH作為抗原免疫動(dòng)物從而得到特異性抗血清，操作簡單；同時(shí)，由于TDH為大分子蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性，整個(gè)免疫周期只需3次免疫效價(jià)就能達(dá)到1:10000，因此在抗血清的制作方面效率更高。

根據(jù)Wester斑點(diǎn)印跡原理，將TDH作為檢測對象，敏感性更強(qiáng)，特異性更高。本實(shí)驗(yàn)制作的TDH特異性抗血清可以特異性與吸附在硝酸纖維素膜上的TDH結(jié)合(假如待測樣品中含有TDH)，能有效地檢測致病性副溶血弧菌，而對非致病性副溶血弧菌不敏感。而現(xiàn)在的副溶血弧菌的免疫學(xué)檢測方法大多都是針對所有副溶血弧菌，包括環(huán)境中非致病性的副溶血弧菌，很少可以特異性檢測致病因子為TDH的致病性副溶血弧菌，因此此方法在檢測有TDH的致病性副溶血弧菌方面是其他方法無法比擬的。

實(shí)驗(yàn)得到的最佳工作濃度為1:3200，一只小鼠斷尾取血所得的抗血清至少可以檢測300個(gè)樣品，大大超過了目前應(yīng)用于檢測致病菌一般Dot-ELISA方法的工作濃度(1:200左右)[15]，效率更高，更加有效地檢測出致病性副溶血弧菌。

采用Western斑點(diǎn)印跡法技術(shù)檢測致病性副溶血弧菌只需7～9h，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程簡便易行、特異性高、無需特殊儀器設(shè)備，用肉眼即可判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，適合在基層單位推廣，可為致病性副溶血弧菌的檢測提供一種簡單、快速、有效的方法。

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Detection of Pathogenic Vibrio parahaemolyticus by Western Blotting

YANG Jing-ya，ZHANG Jian，ZHAO Yong，TAO Yan，LU Xiao-fan，CHAO Ruo-yu
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Objective: To purify thermostable direct hemolysin (TDH) from the culture of Vibrio Parahaemolyticus and to establish western blotting method for determining pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Methods: The specific anti-serum was obtained from immune mice using TDH. The working concentration of serum samples was determined by chessboard assay. The specificities of pathogenic Vibrio parahaemolyticus and non-pathogenic Vibrio parahaemolyticus were also determined. Results: The working concentration of serum samples was 1:3200. The samples with clear dots were judged as the positive reaction. V. parahaemolyticus was positive in pathogenic Vibrio parahaemolyticus, while non-pathogenic Vibrio parahaemolyticus was negative. Conclusion: Western blotting can be used to detect pathogenic Vibrio parahaemolyticus with the characteristics of high sensitivity, simple operation and eye-observable results.

TDH；Western blotting；pathogenic Vibrio parahaemolyticu；detection

R446.61

A

1002-6630(2010)20-0413-04

2010-06-29

上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目(09YZ265)；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

楊靖亞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源綜合利用與海洋藥物的開發(fā)、腫瘤藥理學(xué)。E-mail：jyyong@shou.edu.cn