高效毛細(xì)管電泳法在黃酮類化合物分析檢測(cè)中的應(yīng)用

周一鳴，周小理,*，崔琳琳

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200235；2.上海商學(xué)院食品工程系，上海 200235)

高效毛細(xì)管電泳法在黃酮類化合物分析檢測(cè)中的應(yīng)用

周一鳴1，周小理1,*，崔琳琳2

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200235；2.上海商學(xué)院食品工程系，上海 200235)

建立一種高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法測(cè)定黃酮類化合物含量的方法。電解質(zhì)溶液以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)作為緩沖液，在25℃、20kV壓力條件下進(jìn)行電泳，245nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，線性關(guān)系良好，在10min內(nèi)黃酮類化合物完全分離，符合定性研究和定量測(cè)定的要求。該方法具有較好的分離效果和良好的精密度，可應(yīng)用于黃酮類化合物的測(cè)定。

黃酮類化合物；高效毛細(xì)管電泳

高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE) 是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為主要驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)。相比傳統(tǒng)電泳和高效液相色譜(HPLC)，它具有高效、快速、高靈敏度、高度自動(dòng)化等特點(diǎn)，并且所需樣品量和溶劑消耗少、運(yùn)行成本低、對(duì)環(huán)境污染小[1]。在一臺(tái)HPCE儀器上可兼容多種分離模式，因此適用樣品范圍廣，已被廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域[2-5]。

蘆丁和槲皮素作為兩種重要的黃酮類化合物，在植物中大量存在，目前對(duì)其分析測(cè)定方法有高效液相色譜法、熒光光譜法、化學(xué)發(fā)光法等[6]。但采用高效毛細(xì)管電泳法[7-15]同時(shí)檢測(cè)此兩種物質(zhì)未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以蕎麥芽粉為對(duì)象，采用高效毛細(xì)管電泳法一次同時(shí)分離測(cè)定出其中蘆丁和槲皮素的含量，效果良好，可為今后測(cè)定植物樣品中黃酮類化合物(含黃酮類化合物的營(yíng)養(yǎng)食品)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蕎麥 市購。

蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)對(duì)照品 Sigma公司；其他試劑均為分析純；水為二次重蒸水。

CL3030型高效毛細(xì)管電泳儀 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司；未涂層彈性石英毛細(xì)管柱(50cm×50cm，75μm，有效長(zhǎng)度40cm) 河北永年光導(dǎo)纖維廠；電子天平、pH計(jì) Metiler Toledo公司；超聲波清洗器 昆山超聲波有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁10.8mg、槲皮素9.9mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為1.08mg/mL，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.99mg/mL。精密稱取桑色素7.8mg，用甲醇定容至25mL，得到桑色素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.312mg/mL。

1.2.2 樣品溶液制備

蕎麥芽經(jīng)冷凍干燥后粉碎，在60℃條件下干燥至質(zhì)量恒定。精密稱取蕎麥芽粉樣品1.0g，放入三角瓶中，加入甲醇20mL，稱量。超聲提取40min，擦凈瓶外壁水，冷卻至室溫后稱量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失。過濾，取濾液，3000r/min離心3min后進(jìn)行HPCE檢測(cè)。

1.2.3 電泳條件

該條件為根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件。以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)為電泳緩沖液，未涂層彈性石英毛細(xì)管，20kV恒壓條件下電泳分離，245nm處檢測(cè)。所有溶液使用前使用0.45μm濾膜過濾，每次運(yùn)行后依次以0.10mol/L NaOH溶液、超純水和電泳緩沖液分別沖洗5min。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.8mg、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品9.9mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為1.08mg/mL，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.99mg/mL。分別取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容到10mL，得到6個(gè)質(zhì)量濃度水平。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)(x)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍和最低檢測(cè)限和定量限Table1 Figures of merit of standard curves as well as limits of detection and quantification of rutin and quercetin

由表1可知，本方法對(duì)照品溶液吸取量在0.1～5.0mL之間時(shí)，測(cè)試結(jié)果與被測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃呈良好線性關(guān)系，因此，本方法可作為蕎麥芽粉蘆丁和槲皮素含量的測(cè)定方法。圖1表明該方法有良好的檢出效果。

圖1 混標(biāo)(A)和蕎麥(B)的HPEC圖譜Fig.1 HPEC chromatograms of mixed rutin and quercetin standards and flavonoid compounds extracted from buckwheat sprouts

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取制備好的蕎麥芽粉提取液樣品，于0、12、24、36、48、72h分別進(jìn)樣，重復(fù)6次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蘆丁、槲皮素含量分別為6.40mg/g和5.19mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別1.9%和1.5%。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取制備好的蕎麥芽粉提取液樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蘆丁、槲皮素含量分別為6.58mg/g和5.47mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%和2.1%?？芍肏PCE法測(cè)定蕎麥芽中黃酮化合物含量，結(jié)果變異系數(shù)較小，說明該方法的重現(xiàn)性準(zhǔn)確性良好，且測(cè)定條件易控制，測(cè)定結(jié)果較滿意。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批的蕎麥芽粉提取液樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蘆丁、槲皮素含量分別為6.76mg/g和5.28mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%和2.0%。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表2 蕎麥芽中黃酮化合物含量測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)Table2 Spike recoveries of the method for rutin and quercetin

采用加樣回收率法，精密稱取1.0g蕎麥芽粉，加入蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液各5mL，用1.2.2節(jié)方法進(jìn)行提取檢測(cè)，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。平均回收率分別為91.9%和96.0%，RSD為2.1%和2.8%，測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值接近的程度較好，準(zhǔn)確度較高。因此以蘆丁、槲皮素為對(duì)照品，利用HPCE法測(cè)定蕎麥芽粉中黃酮化合物含量符合微量成分分析要求，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立測(cè)定蕎麥芽粉中蘆丁、槲皮素黃酮類化合物含量的高效毛細(xì)管電泳法，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證得知，本法線性關(guān)系良好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性可靠、回收率高，方法簡(jiǎn)單可靠，為實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確測(cè)定植物樣品中黃酮類化合物含量提供了一種新的方法。

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Application of High Performance Capillary Electrophoresis to the Determination of Flavonoid Compounds

ZHOU Yi-ming1，ZHOU Xiao-li1,*，CUI Lin-lin2
(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200235, China；2. College of Food Science, Shanghai Business School, Shanghai 200235, China)

A method was developed for the determination of flavonoid compounds using high performance capillary electrophoresis (HPCE). The electrolyte buffer used was 20 mmol/L borax/boracic acid solution (pH 8.4). Electrophoresis was performed at 25 ℃ and 20 kV voltage. The detection wavelength was set as 245 nm. The developed method displayed good linearity. A thorough chromatographic separation of flavonoid compounds was achieved within 10 min, which meets the requirements for qualification and quantification. This method giving good separation and having high precision is applicable for the determination of flavonoid compounds in practice.

flavonoids；high performance capillary electrophoresis (HPCE)

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0275-03

2009-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071527)；上海市優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(yyy09013)；上海市科委重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(074905114)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題(2006BAD02B06/18)

周一鳴(1981—)，男，助教，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：zhouym@sit.edu.cn

*通信作者：周小理(1957—)，女，教授，研究方向?yàn)槭称沸沦Y源深度開發(fā)與利用。E-mail：zhouxl@sit.edu.cn