檳榔中檳榔堿的乙醇回流提取工藝研究

羅士數(shù)，張海德*，朱 莉，劉小玲

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

檳榔中檳榔堿的乙醇回流提取工藝研究

羅士數(shù)，張海德*，朱 莉，劉小玲

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228)

采用加熱回流提取法從檳榔中提取檳榔堿。以檳榔堿得率為考察指標(biāo)，用高效液相色譜法測(cè)定其含量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)得出檳榔中檳榔堿的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1:14 (g/mL)、提取溫度85℃、堿化pH8。此條件下檳榔堿得率為(0.251±0.03)%。

檳榔；檳榔堿；回流提取工藝

檳榔(Areca nut)是棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子，在我國(guó)已有1500多年的栽培歷史[1]。檳榔作為一種常用中藥，位居我國(guó)著名四大南藥之首，是54種棕櫚科植物中唯一一種含有生物堿的植物[2]。檳榔的藥用價(jià)值很高，中醫(yī)用作治療蟲(chóng)積、食滯、腹脹痛、水腫、腳氣等癥，在臨床上也常用于驅(qū)蟲(chóng)、抗菌、治療胃病、十二指腸潰瘍等。檳榔堿是檳榔的主要保健和藥理活性成分，具有一定的藥用價(jià)值。

檳榔堿是中藥檳榔飲片和焦檳榔的主要活性成分[3]，它是檳榔的有效驅(qū)蟲(chóng)成分，對(duì)豬肉、牛肉絳蟲(chóng)有較強(qiáng)的致癱瘓作用，對(duì)棘球蚴蟲(chóng)有殺傷作用[4]，對(duì)釘螺也有顯著的殺滅作用[5]。Lim等[6]指出：檳榔堿可以通過(guò)類(lèi)膽堿功能受體的激活作用劑量，依賴(lài)性地抑制大鼠離體腎上腺體中兒茶酚胺的釋放。近年來(lái)的研究亦表明，檳榔是具有開(kāi)發(fā)前景的中藥，其主要有效成分檳榔堿被證實(shí)對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)具有一定的促進(jìn)作用[7]，以及抗血栓作用[8]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[9]、抗胃潰瘍作用[10]、防止心腦血管疾病[11]、適量可以緩和血管緊張[12]、改善記憶力[13]、降低血糖[14]、改善老年癡呆癥[15]等藥理保健功效。但是目前臨床上還沒(méi)有檳榔堿制成的有效制劑。因此，研究檳榔堿的提取方法及條件對(duì)于檳榔藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究對(duì)檳榔中檳榔堿進(jìn)行回流提取，采取高效液相色譜法測(cè)定，以檳榔堿的含量為指標(biāo)，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件。這對(duì)中國(guó)熱帶地區(qū)豐富的檳榔資源的綜合開(kāi)發(fā)利用、提高檳榔產(chǎn)品附加值、促進(jìn)檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展等均有重大意義，并為擴(kuò)大檳榔堿新藥源提供參考，以及檳榔堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔鮮果采自海南大學(xué)(儋州校區(qū))熱帶植物園內(nèi)，為海南品種，取檳榔殼和籽45℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過(guò)篩，即為檳榔殼和檳榔籽原料。

無(wú)水乙醇、氯仿、濃氨水、氫溴酸、無(wú)水硫酸鈉(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；甲醇(色譜純)美國(guó)天地公司；氫溴酸檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀(配有SPD-20A紫外檢測(cè)器和Lcsolution色譜工作站) 日本島津公司；CS101-II型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；HH-S21A型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng)；A11型粉碎機(jī) 德國(guó)IKA公司；PB3002-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱(chēng)取檳榔原料5.00g，量取一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液加入其中，控制一定的水浴溫度加熱回流提取。提取一定時(shí)間后，濾取提取液，殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次。合并3次濾液，進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇，濃縮至浸膏狀之后，加體積分?jǐn)?shù)5%的稀HCl溶解，充分搖勻后過(guò)濾。濾液逐滴加入體積分?jǐn)?shù)36%的濃氨水調(diào)節(jié)p H值，并攪拌。在堿化液中加入氯仿，充分?jǐn)噭?，裝入分液漏斗，待靜置分層后，放出氯仿層，再用氯仿反復(fù)萃取3～5次。合并萃取液，加適量無(wú)水硫酸鈉脫水過(guò)濾。濾液再減壓濃縮，回收氯仿與氨水的混合液，至浸膏狀后迅速將其溶于無(wú)水乙醇中，冷卻后滴加體積分?jǐn)?shù)5%的氫溴酸調(diào)節(jié)pH值，加適量無(wú)水硫酸鈉脫水過(guò)濾，即得到檳榔堿的乙醇溶液，再將其放于水浴鍋上蒸干(溫度不超過(guò)50℃)，蒸干后加甲醇定容至25mL，再吸取2mL定容至10mL，供色譜檢測(cè)用。

1.3.2 檢測(cè)方法

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱Shim-pack VP-ODS(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇:0.1%(V/V)磷酸=9:1(V/V)；流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；柱溫：室溫(25～30℃)；進(jìn)樣量10μL。采用外標(biāo)面積歸一法測(cè)得樣品含量[16]。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品42.02mg，加甲醇定容至25mL，再吸取5mL定容至25mL，即得到質(zhì)量濃度為0.336mg/mL的檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

從已配制的標(biāo)準(zhǔn)液中分別吸取8、6、4、2、0mL，用甲醇定容至10mL，質(zhì)量濃度分別是0.2688、0.2016、0.1344、0.0672、0mg/mL。以峰面積為橫坐標(biāo)，檳榔堿質(zhì)量濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)，其線(xiàn)性回歸方程：Y=2.830×10-8X－1.058× 10-2，R2=0.9999。

圖1 檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of arecoline

1.3.3 數(shù)據(jù)分析及檳榔堿得率的計(jì)算

使用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為x±s。

檳榔堿提取得率/%=m/m0×100

式中：m為高效液相色譜法測(cè)定并計(jì)算得到的提取物中檳榔堿質(zhì)量/g；m0為原料質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 檳榔粉碎粒度的選擇

選擇提取時(shí)間1h、提取溶劑為50mL 75%乙醇溶液、提取溫度85℃、堿化pH10，測(cè)定檳榔堿得率，對(duì)檳榔果不同部位和不同粉碎度進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 檳榔果殼和籽的檳榔堿得率Fig.2 Comparison on extraction rates of arecoline from different parts of betel nut

從圖2可以看出，檳榔殼的檳榔堿得率要高于檳榔籽，而且原料粉碎粒度在過(guò)20～60目篩范圍內(nèi)，隨著粉碎粒度的減小檳榔堿得率逐漸增大，而在過(guò)80目篩后檳榔堿得率反而降低。原因可能是粉碎粒度太細(xì)導(dǎo)致原料表面張力增大，不利于有效成分的溶出。故原料粉碎粒度選擇過(guò)60目篩為宜。

2.1.2 提取溶劑的選擇

檳榔堿及其鹽都能溶于甲醇和乙醇。甲醇的沸點(diǎn)比乙醇低，極性比乙醇大，對(duì)生物堿鹽類(lèi)的溶解性能也比乙醇好，但它對(duì)視神經(jīng)的毒性很大，所以多數(shù)用乙醇作為提取溶劑。

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，按料液比1:10(g/mL)分別加入體積分?jǐn)?shù)45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次，堿化pH10，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)檳榔堿得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of arecoline

從圖3可以看出，檳榔堿的得率在45%～85%體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，85%時(shí)達(dá)到最大，至體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)得率反而減小，但下降幅度不大，原因是高體積分?jǐn)?shù)的乙醇把其他脂溶性雜質(zhì)成分提取出來(lái)，影響了檳榔堿的溶出。故可選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)85%為最佳。

2.1.3 料液比對(duì)檳榔堿得率的影響

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，分別按料液比1:8、1:10、1:12、1:14、1:16(g/mL)加入85%乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次，堿化p H 1 0，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)檳榔堿得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of arecoline

從圖4可以看出，隨著溶劑量的增大，檳榔堿得率也越大。其原因是溶劑量越多，溶劑與浸提物的接觸越充分，能在相同時(shí)間內(nèi)溶解出更多的檳榔堿，使得率增大。當(dāng)料液比達(dá)到1:14(g/mL)時(shí)，檳榔堿得率增加不明顯，說(shuō)明檳榔堿的溶解已基本飽和。故選擇料液比1:14(g/mL)為最佳。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ǚ謩e提取0、1、2、3、4次，即提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次，堿化pH10，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取次數(shù)的選擇Fig.5 Effect of extraction number on extraction rate of arecoline

從圖5可以看出，當(dāng)提取1～3次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，提取得率逐漸增加，當(dāng)提取大于3次時(shí)，檳榔堿得率增加不明顯，表明檳榔堿已提取完全，因此重復(fù)提取3次即可。

2.1.5 堿化pH值對(duì)檳榔堿得率的影響

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中回流提取1h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次，堿化時(shí)分別調(diào)pH6、7、8、9、1 0、1 1，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 堿化pH值對(duì)檳榔堿得率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction rate of arecoline

從圖6可以看出，堿化pH值對(duì)檳榔堿得率的影響較為明顯，當(dāng)堿化pH值小于8時(shí)，得率隨著pH值的增大而明顯增加，其原因是與鞣酸結(jié)合的檳榔堿在加入了濃氨水后不斷被游離出來(lái)。當(dāng)pH值大于8時(shí)，檳榔堿得率逐漸下降，其原因可能是檳榔堿在堿性條件下水解生成甲醇和檳榔次堿的緣故。故最佳pH值為8。

2.1.6 提取時(shí)間的選擇

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，在85℃水浴中分別回流提取0.5、1、1.5、2、2.5h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次，堿化pH8，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 提取時(shí)間的選擇Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of arecoline

從圖7可以看出，當(dāng)提取時(shí)間小于1h時(shí)，檳榔堿得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)大于1 h后，變化趨于平緩，說(shuō)明提取1h可將檳榔堿提取完全。從節(jié)省時(shí)間角度考慮，選擇1h為最佳提取時(shí)間。

2.1.7 提取溫度的選擇

稱(chēng)取研碎的檳榔殼粉末5.00g，按料液比1:14(g/mL)加入85%的乙醇溶液，分別在45、55、65、75、85、95℃水浴中回流提1h，提取完后殘?jiān)偃缟戏ㄌ崛?次，堿化p H 8，測(cè)定檳榔堿得率，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 提取溫度的選擇Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction rate of arecoline

從圖8可以看出，在45～85℃溫度范圍內(nèi)，檳榔堿得率隨著溫度的升高而顯著增大，這是因?yàn)闇囟鹊纳哂兄趥髻|(zhì)過(guò)程，使分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)激烈，加快檳榔堿在溶液中擴(kuò)散和乙醇的滲透，同時(shí)提取液黏度隨溫度升高而降低，從而使檳榔堿溶出速度加快。溫度大于85℃后檳榔堿得率增加不明顯。故選擇85℃為最佳。2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表1 因素水平表Table1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 檳榔堿提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、堿化pH值(D)4因素，各取3水平(表1)，按正交設(shè)計(jì)表L9(34)安排試驗(yàn)。按1.3.2節(jié)方法測(cè)定檳榔堿得率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2結(jié)果表明，各因素對(duì)檳榔堿得率影響大小次序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞堿化pH值＞料液比＞提取溫度，比較k值得最優(yōu)條件組合為A2B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、堿化pH8、料液比1:18(g/mL)、提取溫度85℃。由表3的方差分析結(jié)果可知，在各因素水平范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)檳榔堿得率影響極顯著。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取檳榔粉末5.00g，按最佳工藝條件A2B3C2D2進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定檳榔堿得率，計(jì)算得檳榔堿的平均得率為(0.251±0.03)%，高于正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)的含量，說(shuō)明最佳工藝合理。

3 結(jié)論與討論

在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出了乙醇回流提取檳榔堿的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1:14(g/mL)、提取溫度85℃、堿化pH8。在此工藝條件下，檳榔堿的得率可達(dá)(0.251±0.03)%。

用氫溴酸調(diào)pH值時(shí)，由于氫溴酸的氧化性，pH值不宜調(diào)太低，一般調(diào)至3.0，可使檳榔堿盡可能地完全轉(zhuǎn)化成氫溴酸檳榔堿。此外，在檳榔堿的提純過(guò)程中，反復(fù)的提取分離會(huì)造成檳榔堿的損失，因此，提取工藝還有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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Optimizing the Ethanol Reflux Extraction of Arecoline from Betel Nut Husk

LUO Shi-shu，ZHANG Hai-de*，ZHU Li，LIU Xiao-ling
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The extraction of arecoline from betel nut husk was performed using ethanol refluxing. Arecoline content in the extract was determined by HPLC as the evaluation indicator. The optimal extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration, 85%; material/liquid ratio, 1:14 (g/mL); extraction temperature, 85 ℃; and pH 8. The extraction rate of arecoline was (0.251 ± 0.03)% under these conditions.

betel nut；arecoline；ethanol reflux extraction

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0106-05

2010-06-08

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD76B03)；海南大學(xué)科研基金項(xiàng)目(Rndy200501；hd09xm83)

羅士數(shù)(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)闊釒Ч呱罴庸ぁ-mail：luoshishu@126.com

*通信作者：張海德(1970—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)闊釒мr(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：zhanghaide@163.com