黃瓜枯萎病菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

蔡學(xué)清，謝玲平，胡方平

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum)引起的黃瓜枯萎病是一類經(jīng)土壤傳播的維管束病害，在我國(guó)瓜類種植區(qū)普遍發(fā)生，并己成為生產(chǎn)上制約黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年黃瓜的發(fā)病率可達(dá)20%，甚至高達(dá)80%-90%，導(dǎo)致黃瓜嚴(yán)重減產(chǎn)(李平生，2003)。

目前對(duì)于該病害的防治主要采用采用化學(xué)防治，而化學(xué)農(nóng)藥則易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等弊端(陳志杰等，2006)，因此生物防治成為目前研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已有一些關(guān)于黃瓜枯萎病的生物防治的研究報(bào)道，如Paulita等從1987年開始研究黃瓜枯萎病的生物防治及其可能的機(jī)制(Paulita and Park，1987);范寰篩選到8株對(duì)黃瓜枯萎病菌有強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌，抑菌直徑達(dá)18-32 mm，對(duì)黃瓜胚根和幼苗生長(zhǎng)均有促生作用，混合培養(yǎng)液防效可達(dá)70．27%(范寰，2000);等從植物根際土壤中分離出了一株具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性的促生拮抗的雙功能假單胞菌M18，用M18活菌浸種春黃瓜種子，黃瓜枯萎病的發(fā)病率下降70%-80%，產(chǎn)量提高20%以上(許煌泉等，1999);從浙江大學(xué)華家池蔬菜所和杭州市蔬菜所的老熟菜地的土壤中分離篩選出對(duì)黃瓜猝倒病和黃瓜中期枯萎病分別具有離體拮抗作用的細(xì)菌 ZJ14(Bacillus subtilis)，ZJ32S1(B．subtilis)，ZJ45(Pseudomonas aeruginosa)菌株，通過(guò)促芽試驗(yàn)和無(wú)菌土盆栽測(cè)定，發(fā)現(xiàn)ZJ14和ZJ32S1菌株能促進(jìn)黃瓜種子的萌發(fā)和黃瓜苗的生長(zhǎng)，增加苗干物質(zhì)重量，對(duì)黃瓜猝倒病和黃瓜中期枯萎病具有防病效果(張震，2004);吳加志進(jìn)行溫室防治實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芽孢桿菌和假單胞桿菌屬中的一些菌株，對(duì)黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果(吳加志，1996);岳東霞等研究證明假單胞菌類對(duì)土傳病原菌黃瓜枯萎病菌和棉花枯萎病菌有抑制作用，對(duì)黃瓜枯萎病的苗期防效達(dá)67．5%(岳東霞等，2002);而洪鵬翔等從番茄、茄子、煙草和辣椒健康植株體內(nèi)分離篩選出3株對(duì)黃瓜枯萎病有20．83%-79．17%的防病效果的內(nèi)生細(xì)菌(洪鵬翔等，2007)。

植物內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，不易受外界環(huán)境的影響，可以較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮生物學(xué)作用，同時(shí)它們還可以作為外源基因受體菌，構(gòu)建具有內(nèi)生、促生、防病等多功能內(nèi)生生防工程菌。因此，本研究以黃瓜枯萎病菌為對(duì)象，從黃瓜體內(nèi)分離篩選對(duì)該病菌具有抑制作用的細(xì)菌菌株，為防治黃瓜枯萎病生物制劑的產(chǎn)業(yè)化提供有效菌株。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 供試黃瓜品種 黃瓜“鹽津7號(hào)”。

1．1．2 供試病原菌 黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株TL-2均由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1．1．3 培養(yǎng)基(方中達(dá)，1998) NA(蛋白胨 5．0 g;牛肉浸膏 3．0 g;葡萄糖 2．5 g;酵母粉1．0 g;瓊脂粉16．0-18．0 g;蒸餾水 1 L;PH 7．0-7．2)、PDA(馬鈴薯 200 g;蛋白胨 5．0 g;葡萄糖(或蔗糖)20．0 g;瓊脂 16．0-18．0 g;蒸餾水 1 L)、KB(蛋白胨 20．0 g;MgSO4·7H2O 1．5 g;K2HPO4·H2O 1．8 g;純甘油 10．0 mL;瓊脂粉 16．0-18．0 g;蒸餾水 1 L;pH 7．2-7．4)、TSA(胰蛋白胨 15．0 g;大豆胨 5．0 g;NaCl 5．0 g;瓊脂 16．0-18．0 g;蒸餾水 1 L;pH 7．2-7．4)、蛋白胨水培養(yǎng)基(蛋白胨 10．0 g;NaCl 5．0 g;蒸餾水 1 L;pH 7．2-7．4)

1．2 黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的分離

參照何紅等(2002)方法。從黃瓜的莖、花、葉、果上各取組織1．0 g，用70%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水漂洗后，置于1%次氯酸鈉中表面消毒3-5 min(其中葉片和花3 min，莖和果5 min)，取出后用無(wú)菌水沖洗3次。樣品晾干后分別置于無(wú)菌研缽中并加5 mL無(wú)菌水研磨成漿狀，靜置10-15 min后，每一樣品各取上層澄清液50 μL分別涂布在培養(yǎng)基(NA、KB和TSA)平板上，每種培養(yǎng)基涂布3皿，28℃黑暗培養(yǎng)48-72 h，計(jì)算每一平板的菌落數(shù)。表面消毒后研磨前，取50 μL最后一次無(wú)菌水沖洗液涂布平板或者是采用組織印跡試驗(yàn)，將最后一次清洗的植物組織在培養(yǎng)基平板上印一下，同上述條件下培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)菌落產(chǎn)生，以驗(yàn)證消毒方法是否能殺死供試材料表生微生物。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，劃線分離、純化后保存，供測(cè)試鑒定。

1．3 黃瓜枯萎病菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

采用對(duì)峙生長(zhǎng)法，測(cè)定所有分離菌株對(duì)黃瓜枯萎病菌的拮抗作用。在PDA平板中央接入直徑為5 mm的真菌菌絲塊，48 h后在平板四個(gè)邊緣距中央中心處接入一小環(huán)細(xì)菌菌落，28℃下黑暗培養(yǎng)，設(shè)不接種的處理為對(duì)照，72 h后觀察真菌菌落大小以及形成的抑菌圈和抑菌帶。

1．4 內(nèi)生拮抗菌株的鑒定

1．4．1 菌株的培養(yǎng) 將供試菌株接種在NA斜面上，28℃培養(yǎng)18-72 h后備用，或配成3×108cfu·mL-1的菌懸液備用。

1．4．2 形態(tài)觀察和生理生化測(cè)定 參照方中達(dá)(1998)的方法和東秀珠和蔡妙英(2001)的方法。

2 結(jié)果與分析

2．1 黃瓜內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離結(jié)果

用三種不同培養(yǎng)基分離黃瓜體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)果表明(表1)，黃瓜不同部位﹙花、莖、葉、果﹚均存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為2．9×103-25．6×103cfu·(g·FW)-1。從不同部位來(lái)看，葉片中的細(xì)菌數(shù)量比其他部位多，花中的細(xì)菌數(shù)量比莖中的細(xì)菌數(shù)量多，果中的細(xì)菌數(shù)量最少。從不同培養(yǎng)基來(lái)看，在NA培養(yǎng)基中分離到的細(xì)菌數(shù)量比其他培養(yǎng)基的細(xì)菌數(shù)量多，在TSA培養(yǎng)基中分離到的細(xì)菌數(shù)量最少。由此可見，植物的不同部位其內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量不同，不同的培養(yǎng)基分離植物的同一部位其內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也不同。

表1 黃瓜不同器官分離出的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量(×103cfu·(g·FW)－1)Table 1 Population of endophytic bacteria separated from different organs of cucumber(×103cfu·(g·FW)-1)

2．2 黃瓜枯萎病菌拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果

分別從黃瓜葉、花、莖、果上分離的內(nèi)生細(xì)菌中共篩選到對(duì)黃瓜枯萎病菌有不同程度拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌20株(表2)，占分離總數(shù)的33．3%，其中HY3、HY4、HY6等10株對(duì)黃瓜枯萎病菌的拮抗效果較好，其抑菌帶寬度為4．5-8．5 mm(表3)。

2．3 內(nèi)生拮抗菌株的鑒定結(jié)果

2．3．1 菌株的培養(yǎng)性狀 供試菌株在NA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)48 h，菌落為灰白色、圓形或近圓形、邊緣不整齊、凸起呈乳頭狀或中央凹陷、表面干燥、不透明。供試的10株菌株的耐鹽性均達(dá)到5%，部分菌株(HY3、HY6、HJ5、HH2、HY7、HH4和 HH)為 7%;另外，供試菌株在4℃均不能生長(zhǎng)，除了HY4和HJ6菌株外，其余菌株均可在50℃下生長(zhǎng)(表4)。

2．3．2 菌株的形態(tài)和染色反應(yīng) 供試菌株的菌體均呈桿狀，周生鞭毛，革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，芽孢中生或端生。

2．3．3 生理生化性狀 從表5可知:供試的所有菌株好氧或兼性厭氧、接觸酶陽(yáng)性，不產(chǎn)生吲哚和苯丙氨酸脫氨酶，能利用檸檬酸鹽、L-阿拉伯糖、乳糖、D-甘露醇、D-葡萄糖和水解淀粉，這與對(duì)照菌株TL2的測(cè)定結(jié)果一致。但是菌株HH7和HY7不能利用D-木糖、菌株HY3不能還原硝酸鹽、菌株HY3、HY6、HY9 V-P測(cè)定呈陰性，這與對(duì)照菌株TL2不一致，而其他的所有菌株的測(cè)定結(jié)果均與對(duì)照菌株TL2一致。參照東秀珠等(2001)編寫的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定表明，供試的10個(gè)菌株均為芽孢桿菌屬(Bacillus spp．)。

表2 黃瓜枯萎病菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果Table 2 Screening of the antagonistic and endophtic bacteria to Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum

表3 內(nèi)生拮抗菌對(duì)黃瓜枯萎病菌的拮抗能力Table 2 Inhibition activity of endophytic bacterial strains to Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum

3 討論

黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果表明，黃瓜體內(nèi)存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，其種群數(shù)量為2．9×103-25．6 ×103cfu·(g·FW)-1這與前人報(bào)道的植物內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量(一般在 103-105cfu·g-1之間)基本吻合(Quadt-Hallmann and Kloepper，1996);不同培養(yǎng)基上分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量不一樣，不同部位內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量也有一定的差異，其中從葉片中分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量做多，而健康果實(shí)中分離到的內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量最少，這與何紅等從辣椒植株不同部位分離內(nèi)生細(xì)菌所獲得的研究結(jié)果相同(何紅等，2002)。

現(xiàn)已報(bào)道的對(duì)黃瓜枯萎病具有防治效果的拮抗菌株絕大部分是從土壤或植物根際土壤分離的，這些拮抗菌株易受外界條件的影響，田間防病效果不穩(wěn)定，存在著一定的缺陷(李長(zhǎng)松，1992);而植物內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，不易受外界環(huán)境的影響，可以較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮生物學(xué)作用(楊海蓮等，1998;Sturz et al．，2000)，因此，本研究從黃瓜體內(nèi)分離獲得的對(duì)黃瓜枯萎病菌具有拮抗效果的菌株具有較好的應(yīng)用前景，但對(duì)于這些拮抗菌株對(duì)黃瓜枯萎病的田間防治效果如何?能否應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐有效地控制該病害，還有待于進(jìn)一步研究。

表4 目標(biāo)菌株在不同溫度和不同鹽度下的生長(zhǎng)狀況Table 4 Growth of the tested bacterial strains at different temperature and sodium chloride concentration

表5 內(nèi)生細(xì)菌菌株對(duì)碳素化合物的分解和利用及生理生化測(cè)定結(jié)果Table 5 Growth of the tested bacterial strains at different temperature and sodium chloride concentration

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