FXYD-3蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

王大維 閆寶勇 劉廣順 朱振龍 孫曉峰

FXYD-3屬于 FXYD家族的一個(gè)成員，是 Morrison等[1]在家鼠乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種分子量為 8KD的單跨膜蛋白，簡(jiǎn)稱為 Mat-8(mammary tumor，8 kD)，研究發(fā)現(xiàn)其在人乳腺癌和癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)[2]，但在前列腺癌中的表達(dá)下調(diào)[3]。關(guān)于FXYD-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況如何，筆者目前尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究采用免疫組化的方法來檢測(cè) FXYD-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，并初步探討其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本選自河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科 1991至 2007年的存檔蠟塊。其中正?？谇火つ?20例(來自正頜手術(shù)及牙槽嵴修整術(shù))，口腔鱗狀細(xì)胞癌 57例(包括舌癌 18例，頰癌 13例，牙齦癌 26例)，男 30例，女 27例;年齡 26～78歲，平均年齡 52歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 31例;高分化者 41例，低分化者 16例(為統(tǒng)計(jì)學(xué)方便，將中分化和高分化歸類為高分化，將低分化歸為低分化)。所有標(biāo)本均經(jīng)兩位副高以上職稱的病理醫(yī)生復(fù)查確診。

1.2 試劑與方法 石蠟包埋組織做 5μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色和免疫組化 SP法染色。所用鼠抗人 FXYD-3單克隆抗體由孫曉峰博士惠贈(zèng)(瑞典林雪平大學(xué))，二抗、三抗均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組織化學(xué)主要染色步驟:(1)切片脫蠟水化;(2)3%H2O2甲醇滅活內(nèi)源性過氧化物酶;(3)依次滴加一抗、二抗和三抗;(4)DAB顯色;(5)蘇木精復(fù)染;(6)常規(guī)脫水、透明、封片。用已知陽性的乳腺癌組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 染色結(jié)果判斷 以癌細(xì)胞的胞膜和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每例隨機(jī)選取 10個(gè)不重復(fù)、不重疊的高倍視野(10×40)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及所有細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率 =Σ陽性細(xì)胞數(shù)/Σ細(xì)胞數(shù) ×100%。根據(jù)陽性細(xì)胞率進(jìn)行分級(jí)，陰性(-):陽性細(xì)胞率≤5%;弱陽性(+):陽性細(xì)胞率 6%～25%;中等陽性(++):陽性細(xì)胞率 26%～50%;強(qiáng)陽性(+++):陽性細(xì)胞率 ＞50%?？紤]到相似的臨床病理特征，把陰性和弱陽性染色列為陰性組，而把中等陽性和強(qiáng)陽性染色列為陽性組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FXYD-3在正?？谇火つづc口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)FXYD-3蛋白在正?？谇徽衬り栃灾ㄎ挥谏掀ぜ?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜上，以細(xì)胞質(zhì)為主，細(xì)胞核表達(dá)陰性。見圖 1、2。正常口腔黏膜中 FXYD-3陽性表達(dá)率為 10%(2/20)，口腔鱗狀細(xì)胞癌中陰性表達(dá)率為 37%(21/57)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖 1 FXYD-3蛋白在正?？谇火つぶ械谋磉_(dá)(+++)(ABC×400)

圖 2 FXYD-3蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)(+++)(ABC×400)

2.2 FXYD-3蛋白表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系 FXYD-3蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫物大小、大體形態(tài)、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。見表 1。

表 1 FXYD-3蛋白表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

3 討論

FXYD蛋白家族是新近發(fā)現(xiàn)的一組小分子轉(zhuǎn)運(yùn)通道或通道調(diào)節(jié)器，與Na-K-ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能有密切關(guān)系，在生理狀態(tài)及多種病理狀態(tài)下起著重要作用，成為新近醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[4，5]。該蛋白的氨基端包含一個(gè)由 35個(gè)氨基酸組成的特殊序列，以 PFXYD(脯氨酸-苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸)開始，包含 7個(gè)不變氨基酸和 6個(gè)高度保守的氨基酸序列。FXYD蛋白家族現(xiàn)有 7個(gè)成員，都屬于小分子蛋白，他們中有 6個(gè)與 Na-K-ATP酶有關(guān)，并且調(diào)節(jié) Na-K-ATP酶的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[6]。

FXYD-3(也稱 Mat-8)是 Morrison等[1]在 1994年研究鼠類乳腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)分子量為 8 kD的單跨膜蛋白質(zhì)，屬于FXYD家族成員，研究表明，它不僅在人體正常組織中(如肝臟、腸道、前列腺、肺臟、胰腺、腦組織和皮膚等)有一定表達(dá)[4，7]，而且在越來越多的腫瘤組織及瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)。有人應(yīng)用 RT-PCR和 RNA blot等方法對(duì)人乳腺癌中FXYD-3的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 16例人乳腺癌組織中均有明顯表達(dá)，而且還在 11例人乳腺癌細(xì)胞系中有表達(dá)[2]。

但在前列腺癌的研究中卻出現(xiàn)了相反的結(jié)果，Vaarala等[3]對(duì)FXYD-3在前列腺癌細(xì)胞系及良性前列腺增生中的表達(dá)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):FXYD-3在良性增生性病變時(shí)表達(dá)上調(diào)，而在癌細(xì)胞系中則表達(dá)下調(diào)，甚至有的不表達(dá)。而Grzm il等[8]的研究則發(fā)現(xiàn)在 11例前列腺癌組織和對(duì)應(yīng)的 11例正常前列腺組織中，6例前列腺癌中 FXYD-3的表達(dá)比正常組織升高 2～35倍，2例則表達(dá)下降至正常的 20%～50%，另外 3例癌的FXYD-3的表達(dá)則與正常前列腺組織中的表達(dá)相同，而且該研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)前列腺癌的分期越高，F(xiàn)XYD-3表達(dá)越高，且在研究的 6例前列腺癌細(xì)胞系中 FXYD-3均明顯表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20例正?？谇火つそM織中，其陽性表達(dá)率僅為 10%(2/20)，與 FXYD-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率 36%(21/57)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，該結(jié)果與以上多數(shù)研究結(jié)果相同，表明 FXYD-3在癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)正常組織，提示 FXYD-3可能與癌的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示FXYD-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者性別、年齡、腫物大小、大體形態(tài)、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無關(guān)(P＞0.05)，同時(shí)通過對(duì) FXYD-3在瘤組織中央?yún)^(qū)域和邊緣區(qū)域以及血管周圍區(qū)域的染色強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比觀察，也未見明顯差異，這些結(jié)果都似乎提示FXYD-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)上調(diào)，可能只是口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生階段的一個(gè)早期事件，與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系可能不大。

在對(duì)人非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn) FXYD-3在預(yù)后較差的腫瘤中較預(yù)后較好的腫瘤中表達(dá)增加，提示FXYD-3的表達(dá)可能是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個(gè)新的生物學(xué)指標(biāo)[9]。本組資料中缺乏隨訪結(jié)果，對(duì)FXYD-3與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期之間的關(guān)系無法評(píng)估。

總之，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道來看，F(xiàn)XYD-3在多數(shù)腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可能與腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系，至于具體關(guān)系如何以及為什么在某些腫瘤中的表達(dá)結(jié)果相反等問題，尚需大樣本進(jìn)一步探討，推測(cè)對(duì) FXYD-3在腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行深入的研究，有可能對(duì)腫瘤的發(fā)生機(jī)制有進(jìn)一步的了解。

1 Morrison BW，Leder P.Neu and ras initiatemurinemammary tumors that share genetic markers generally absent in c-myc and int-α-initiated tumors.Oncogene，1994，9:3417-3426.

2 Morrison BW，Mooman JR，Kowdley GC，et al.Mat-8，a novel phospholemman-like protein expressed in human breast tumors，induces a chloride conductance in Xenopus oocytes.JBiol Chem，1995，270:2176-2182.

3 Vaarala MH，Porvari K，Kyllonen A，et al.Differentially expressed genes in two LNCaP prostate cancer cell lines reflecting changes during prostate cancer progression.Lab Invest，2000，80:1259-1268.

4 Franzin CM，Gong XM，Teriete P，etal.Structuresof the FXYD regulatory proteins in lipid m icelles and membranes.J Bioenerg Biomembr，2007，39:379-383.

5 Geering K，Beguin P，Garty H，et al.FXYD proteins:new tissue and isoform-specific regulators of Na，K-ATPase.Ann N Y Acad Sci，2003，986:388-394.

6 Delprat B，Bibert S，Geering K.FXYD proteins:novel regulators of Na，K-ATPase.Med Sci(paris)，2006，22:633-638.

7 Sweadner KJ，Rael E.The FXYD gene fam ily of small ion transport regulators or channels:CDNA sequence，protein signature sequence，and expression.Genomics，2000，68:41-56.

8 Grzm il M，Voigt S，Thelen P，et al.Up-regulated expression of the MAT-8 gene in prostate cancer and its siRNA-mediated inhibition of expression inducesa decrease in proliferation of human prostate carcinoma cells.Int JOncol，2004，24:97-105.

9 Gordon GJ，Richards WG，Sugarbaker DJ，et al.A prognostic test for adenocarcinoma of the lung from gene expression profiling data.Cancer Epidem ial Biomarkers Prev，2003，12:905-910.