熱休克蛋白 70對(duì)幼鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

王偉 薛麗霞

心肌保護(hù)的目的是當(dāng)心臟停跳，生理性冠狀動(dòng)脈灌注停止后，由人工降低和(或)維持心肌細(xì)胞的代謝需要，從而最大限度地減少心肌細(xì)胞的缺血性損傷，保障心臟復(fù)跳后最大限度的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，功能代謝等方面正常。心肌保護(hù)的方法，與心肌細(xì)胞自身的代謝狀況、結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)等密切相關(guān)。嬰幼兒未成熟心肌與成熟心肌在上述幾方面都有較大的差異，因此對(duì)成熟心肌的保護(hù)方法不一定適宜于未成熟心肌。隨著先天性心臟病外科手術(shù)的發(fā)展，患者日趨低齡化使得未成熟心肌保護(hù)課題的研究日益重要，故隨著嬰幼兒心臟外科的發(fā)展，未成熟心肌保護(hù)問(wèn)題亟待解決。目前誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSP)多用熱休克法、感染性休克法等。藥物誘導(dǎo)少有報(bào)道，而該方法較其他方法更適于臨床應(yīng)用。在體心肌缺血再灌注更接近活體生理。本實(shí)驗(yàn)采用幼鼠在體心肌缺血再灌注模型，用川芎嗪誘導(dǎo) HSP70以觀察其對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及幼鼠心肌的細(xì)胞的病理改變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，旨在探索更適合未成熟心肌的保護(hù)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 主要儀器:Heracus超速冷凍離心機(jī);Thermo Forma超低溫冰箱;FHS-2型可調(diào)高速勻漿器;小型動(dòng)物呼吸機(jī);全自動(dòng)生化分析儀;多功能心電監(jiān)護(hù)儀;OLYMPUS顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng);JEM-1200EX透射電子顯微鏡。

1.1.2 主要材料及試劑:無(wú)水乙醇 (分析純:北京化工廠20010821);甲醛 (分析純:北京化工廠 20010821);鹽酸川芎嗪注射液[北京四制藥廠京衛(wèi)準(zhǔn)字第(80)第 422號(hào)]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取體重 60～75 g SD幼鼠(＜21 d)96只，雌雄不限。由本院動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為 3組:(1)假手術(shù)(sham control，SC)組，(2)缺血再灌注 (ischem ia reperfusion，IR)組，(3)IMP預(yù)處理后缺血再灌注(TMP p reconditioning ischem ia reperfusion，TMP+IR)組。 3組于 4個(gè)時(shí)間點(diǎn):TMP+IR組腹腔注射 TMP(100 mg/kg)，SC組、IR組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液后 12、24、36、48 h(每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 8只)制作心肌缺血再灌注模型，SC組開(kāi)胸后左前降支只穿線不結(jié)扎。

1.3 手術(shù)操作過(guò)程 20%烏拉坦(4mg/kg)腹腔麻醉，做頸部正中切口，氣管切開(kāi)插管做機(jī)械正壓通氣。通氣頻率65次/min，潮氣量 5～6m l。針電極插入四肢皮下，記錄心電圖。經(jīng)胸骨正中開(kāi)胸，剪開(kāi)心包膜暴露心臟，在冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)起始部，用 0/4 Proleno滑線穿越左前降支下方心肌表層，在線下墊一硅膠管(結(jié)扎 LAD用)，結(jié)扎滑線阻閉左冠狀動(dòng)脈，松開(kāi)滑線后則再通。心肌缺血的確認(rèn)依靠心電圖 ST段抬高，局部心肌變紫、紅且有節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良。各組幼鼠均于結(jié)扎 LAD 30min，再灌注 120m in(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，靜置 150min)后處死。

1.4 樣本的制備 麻醉狀態(tài)下于再灌注 120min后心臟取血2ml，離心(3 000 r/min)15min，制備血清，檢測(cè)肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。取缺血區(qū)心肌組織，4%甲醛溶液固定 24h，光鏡切片，以檢測(cè) HSP 70含量。

1.5 血清CK-MB及LDH的檢測(cè) 于再灌注 120min后心臟取血 2ml，離心(3 000 r/min)15min，制備血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中兩種酶的含量。

1.6 免疫組化SP法檢測(cè)心肌組織HSP 70 陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞漿染成棕黃色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 ˉx±s表示，采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 幼鼠血清 CK-MB濃度測(cè)定結(jié)果 IR、SC組各時(shí)間亞組CK-MB的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IR組CK-MB含量明顯高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR組 CK-MB含量明顯低于 IR組(P＜0.01)，但高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亞組的 CK-MB含量明顯低于 TMP+IR 12 h亞組(P＜0.05)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)有不斷升高的趨勢(shì)。見(jiàn)表 1。

表 1 幼鼠血清 CK-MB濃度測(cè)定結(jié)果n=32，U/L，ˉx±s

2.2 幼鼠血清LDH濃度測(cè)定結(jié)果 IP組、SC組本組各時(shí)間亞組 LDH的含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IR組LDH含量明顯高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR組 LDH含量明顯低于IR組(P＜0.01)，但高于 SC組(P＜0.01)，TMP+IR 24 h亞組的 LDH含量明顯低于TMP+IR 12h亞組(P＜0.05)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)有不斷升高的趨勢(shì)。見(jiàn)表 2。

表 2 幼鼠血清 LDH濃度測(cè)定結(jié)果 n=32，U/L，ˉx±s

2.3 幼鼠心肌組織HSP 70光密度 OD值測(cè)定結(jié)果 SC組僅有少量的HSP 70表達(dá)，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IR組蛋白表達(dá)量高于 SC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0.05)，TMP+IR組 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的光密度值明顯高于 IR組(P＜0.01)，TMP+IR 24、36、48 h亞組 的光密度值高于TMP+IR 12 h亞組(P＜0.05)，以給藥后 24 h亞組 HSP70表達(dá)量最多，光密度值隨時(shí)間的延長(zhǎng)有不斷降低的趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表 3 幼鼠心肌組織 HSP70光密度 OD值測(cè)定結(jié)果n=32，ˉx±s

2.4 幼鼠心肌組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡觀察幼鼠心肌缺血再灌注 120min后的心肌細(xì)胞，SC組:心肌細(xì)胞完整，肌原纖維排列整齊，Z線、M線清晰;富含線粒體且結(jié)構(gòu)正常，嵴排列整齊、密集;核膜完整，染色質(zhì)均勻，細(xì)密(圖 1)。IR組:肌原纖維部分溶解，Z線增寬、扭曲，其它各帶模糊，肌膜線粒體膜破損明顯，可見(jiàn)線粒體腫帳，嵴排列紊亂，局部或整個(gè)線粒體嵴斷裂溶解和空泡化，局部核膜破壞(圖 2)。TMP+IR組:肌纖維結(jié)構(gòu)基本正常，Z線、M線清晰可見(jiàn)，肌纖維排列較整齊，線粒體嵴較密集，無(wú)明顯空泡形成，核膜完整(圖 3)。

圖 1 幼鼠正常心肌超微結(jié)構(gòu)(×6 600)

圖2 IR組心肌超微結(jié)構(gòu)(×6 600)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用在體幼鼠未成熟心肌缺血再灌注損傷模型，觀察藥物預(yù)處理對(duì)未成熟心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，及初步探討川芎嗪誘導(dǎo) HSP 70對(duì)心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。

目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷模型的制備主要有離體心臟灌注模型(即 Langendorff灌注模型)、在體心臟冠脈結(jié)扎、心肌細(xì)胞培養(yǎng) 3種方法，而對(duì)于未成熟心肌的研究，由于造模動(dòng)物體形較小，LAD纖細(xì)，如采用在體結(jié)扎法手術(shù)難度較大，故其造模方法主要為離體心臟灌注和心肌細(xì)胞培養(yǎng)。但是這兩種方法由于脫離了機(jī)體內(nèi)環(huán)境，斷絕了機(jī)體的神經(jīng)、體液的調(diào)節(jié)及各臟器之間的協(xié)調(diào)性而不能很好的模擬活體處于心肌損傷時(shí)的狀態(tài)和環(huán)境條件。所以本實(shí)驗(yàn)采用幼鼠(4～21 d)在體心臟冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法以摒棄前兩種方法的不足，從而更好地模擬嬰幼兒先天性心臟病術(shù)后心肌損傷發(fā)病情況。心肌缺血再灌注損傷程度與缺血和再灌注時(shí)間有密切關(guān)系，為了能成功制造心肌缺血再灌注損傷模型，避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率過(guò)高，故選擇缺血 30m in，再灌注 120min的時(shí)間，并作了預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型是成功的。心肌缺血再灌注損傷的主要原因之一是通過(guò)黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量氧自由基，同時(shí)體內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等自由基清除劑酶活性降低，組織內(nèi)抗氧化能力下降。大量心肌酶CK、LDH等從壞死的心肌細(xì)胞中漏出。膜對(duì)離子的轉(zhuǎn)移功能產(chǎn)生障礙，引發(fā)心肌細(xì)胞電活動(dòng)紊亂，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常。血清中 CK-MB(能較準(zhǔn)確的反映心肌的損傷程度)和LDH的活性可反映心肌缺血再灌注損傷的程度;電鏡下可直觀地觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)超微變化，因此，本實(shí)驗(yàn)以血清中CK-MB和 LDH活性及電鏡下的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)超微變化，來(lái)初步評(píng)價(jià)川芎嗪誘導(dǎo)HSP 70對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響是可行的。

由于考慮到臨床的可行性，本實(shí)驗(yàn)采取川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP四甲基吡嗪)腹腔注射來(lái)誘導(dǎo) HSP 70的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明是可行的:川芎嗪干預(yù)組心肌 HSP 70的含量明顯高于缺血再灌注組，且各項(xiàng)指標(biāo)反映該組心肌的損傷情況比缺血再灌注組明顯減輕，受損心肌得到保護(hù)。川芎嗪注射液臨床上常用于抗血小板聚集，擴(kuò)張小動(dòng)脈改善微循環(huán)，有活血化瘀的作用，對(duì)已聚集的血小板有解聚的作用。

Currie等[1]研究認(rèn)為HSP的誘導(dǎo)不僅增強(qiáng)心肌功能修復(fù)而且也增強(qiáng)心肌內(nèi)皮功能恢復(fù)，并可延長(zhǎng)心臟停跳時(shí)間，這進(jìn)一步說(shuō)明 HSP與心肌保護(hù)之間的密切關(guān)系。HSP 70轉(zhuǎn)基因鼠的心肌抗缺血再灌損傷能力顯著提高，直接證明了 HSP 70的心肌保護(hù)作用[2，3]。Amrani等[4]研究認(rèn)為 HSP的誘導(dǎo)不僅增強(qiáng)心肌功能恢復(fù)而且也增強(qiáng)心肌內(nèi)皮功能恢復(fù)，可延長(zhǎng)心臟停跳時(shí)間，為心臟移植的供體保護(hù)提供了新方法。有研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血時(shí)間小于30min是可逆性損傷階段，心肌未壞死而出現(xiàn)心肌頓抑，心肌頓抑能誘導(dǎo) HSP的表達(dá)[5，6]。這也可能是在本實(shí)驗(yàn) IR組中受損心肌有一定量HSP 70表達(dá)的原因，但是此種心肌頓抑誘導(dǎo)方式還不足以對(duì)受損心肌產(chǎn)生足夠的保護(hù)作用。而藥物干預(yù)組的 HSP 70含量卻明顯增加，心肌的保護(hù)效果較好，推測(cè)可能還是川芎嗪為HSP 70的主要誘導(dǎo)因素。目前在誘導(dǎo) HSP 70進(jìn)行機(jī)體器官保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HSP 70在誘導(dǎo)后 24 h達(dá)到最高峰值，對(duì)組織器官的保護(hù)效果也達(dá)到最好。Currie等[1]將SD大鼠行熱休克預(yù)處理，待其恢復(fù) 24h后進(jìn)行離體 Langendorff心臟缺血 /再灌注試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱休克組明顯改善缺血/再灌注損傷后心肌力學(xué)指標(biāo)的恢復(fù)，減少心肌肌酸激酶釋放，減輕心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，而心肌中過(guò)氧化氫酶(catalase)活性明顯高于對(duì)照組。Karmazyn等[7]將雄性大鼠置熱環(huán)境中使其肛溫升至 42℃并維持 15min，在其恢復(fù)后不同時(shí)間檢測(cè)心肌HSP表達(dá)及心功能指標(biāo)，結(jié)果表明:恢復(fù)后 24 h誘導(dǎo)出HSP高表達(dá)，心功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組，熱休克組冠狀動(dòng)脈流出液中肌酸肌酶明顯低于對(duì)照組。這在本實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí):在川芎嗪干預(yù)后24h亞組心肌 HSP 70表達(dá)量最高，心肌 CK-MB、LDH含量較其他各組下降明顯，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，在這一點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相符。而在隨后的 36 h亞組、48h亞組HSP 70則呈逐漸下降的趨勢(shì)，心肌保護(hù)效果也逐漸下降，HSP70的這一表達(dá)特性在將來(lái)臨床手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇上對(duì)我們有重要的提示。CK廣泛存在于細(xì)胞漿中，尤以心肌細(xì)胞為多，而 CK-MB是其較敏感反映心肌損傷的同工酶。當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時(shí)CK-MB滲出，血液中活性升高，故血清 CK-MB活性越高，證明心肌損傷亦越重，LDH亦然。本實(shí)驗(yàn)以血清LDH、CK-MB活性來(lái)判斷心肌損害程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血再灌注組血清 LDH、CK-MB顯著增多，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.01)。川芎嗪干預(yù)組血清 LDH、CK-MB明顯降低(與缺血再灌注組比較P＜0.01)。

心肌保護(hù)的目的是當(dāng)心臟停跳，生理性冠狀動(dòng)脈灌注停止后，由人工降低和/(或)維持心肌細(xì)胞的代謝需要從而最大限度地減少心肌細(xì)胞的損傷，保障心臟復(fù)跳后最大限度的結(jié)構(gòu)完整和功能代謝等方面正常[7]。心肌保護(hù)的方法，與心肌細(xì)胞自身的代謝狀況、結(jié)構(gòu)、代謝功能特點(diǎn)等密切相關(guān)[8，9]。我們發(fā)現(xiàn)臨床上術(shù)前就已經(jīng)處于缺氧狀態(tài)的嬰幼兒先心病患者占先心病總數(shù)的 15%～30%。缺氧未成熟心肌與正常未成熟心肌的區(qū)別在于前者在術(shù)前就已經(jīng)存在缺氧損害，隨著缺氧增加，高能磷酸鹽水平下降，產(chǎn)生酸中毒，導(dǎo)致心肌收縮力下降和心功能衰退[10]。無(wú)氧代謝增加，減少了糖原水平，使心肌對(duì)缺氧耐受力更差[11]。低溫減少氧耗并不能終止氧耗，且干擾心肌能量的生成，使缺氧心肌即使是在含有較豐富代謝底物的環(huán)境中，也不能充分利用，不利于能量的再生[12]。另外，快速降溫易產(chǎn)生冷攣縮，產(chǎn)生心肌的無(wú)意義舒縮活動(dòng)，反而消耗能量。在本研究中缺血再灌注組心肌受損較重，電鏡超微觀察心肌肌節(jié)斷裂，線粒體腫脹明顯，內(nèi)外膜模糊不清，嵴斷裂消失。川芎嗪干預(yù)組肌原纖維排列整齊，各肌節(jié)清晰，線粒體損傷較輕，可見(jiàn)線粒體輕度腫脹，內(nèi)外膜較清晰，未見(jiàn)破碎線粒體。HSP 70作為一種在進(jìn)化過(guò)程中有高度保守性的應(yīng)激蛋白，它在防止熱應(yīng)激和其它應(yīng)激引起的細(xì)胞損害或者使受損的細(xì)胞恢復(fù)方面起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用川芎嗪預(yù)處理誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生HSP 70，通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察，證實(shí)應(yīng)用川芎嗪來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生HSP70的方法是可行的。

1 Currie RW，Karmazyn M，Mailer K.Heat-shock response isassociated with enhanced postischem is ventricular recovery.Cite Res，1988，63:543.

2 Flaherty JT，Weisfeldt ML.Reperfusion injury.Free Rad Biol Med，1988，5:409-419.

3 張敏，浦鈞宗，朱全.預(yù)處理的心肌保護(hù)作用及應(yīng)用前景.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2000，19:28-29.

4 Am raniM，Corbett J，Allen NJ，et al.Inducation of heat shockproteins enhances myocardial and endothelial funtional recovery afterprolonged cardioplegic arrest.Ann Thorac Surg，1994，57:157.

5 路海棠，趙鳳琴.降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠心肌缺血損傷熱休克蛋白 70和核因子-kB的影響.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008，11:1941.

6 Burton RD，Mac Kenzie WE.Heart pathology associated with highsustained Gz.Aviat Space Environ Med，1975，46:1251-1253.

7 Karmazyn M，Mailer K，CurrieRW.Acquisition and decayofheat-shockenhanced postischem is ventricular recovery.Am J Physiol，1990，259:H 424.

8 汪曾煒，徐鳳翔主編.心臟外科學(xué).第 1版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2003.247.

9 Imura HM.Age-dependent and hypoxia-related differences in myocardial protection during pediatric open heart surger.Circulation，2001，103:1551-1156.

10 Julia PL，Buckberg GD.Studiesofmyocardialprotection in theimmature heart.I.Enhanced tolerance of immature versus adult myocardium to global ischemia with reference to metabolic differences.The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，1990，100:879-887.

11 Matthias Karck Adverse Effects of Crystalloid Cardioplegia and Slow Cooling for Protection of Immature Rat Hearts Ann Tborac Surg，1996，62:702-709.

12 Joseph A，David FT.Rapid cooling contracture with Cold cardioplegia.Ann Thorac Surg，1997，63:1353-1360.