新輔助化療對(duì)骨肉瘤組織中 β-catenin蛋白表達(dá)的影響

楊建柱 孫麗霞 丁洋 劉俊茹 王冬 高峰

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，惡性程度高，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。隨著新輔助化療的臨床廣泛應(yīng)用，術(shù)前化療已成為骨肉瘤治療不可缺少的手段。對(duì)術(shù)前化療的反應(yīng)是最敏感的預(yù)后指標(biāo)，且對(duì)指導(dǎo)術(shù)后化療有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin和多種癌的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1，2]。然而迄今 β-catenin蛋白在骨肉瘤中表達(dá)的意義以及新輔助化療對(duì)其表達(dá)影響的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。本研究用免疫組化的方法檢測(cè)骨肉瘤化療前、后β-catenin蛋白表達(dá)變化，旨在探討新輔助化療對(duì)骨肉瘤β-catenin蛋白表達(dá)的影響及其與臨床病理特征的關(guān)系，并觀察化療前、后 β-catenin蛋白表達(dá)變化與腫瘤細(xì)胞壞死率(TCNR)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院 2004年 1月至2008年1月穿刺活檢確診的 54例骨肉瘤病例，先進(jìn)行新輔助化療，再進(jìn)行瘤段切除加假體置換術(shù)。54例骨肉瘤患者中，男 35例，女 19例;年齡12～49歲，平均年齡 22歲。組織學(xué)類型:成骨細(xì)胞型 32例，成軟骨型 12例，成纖維型 5例，特殊類型 5例(毛細(xì)血管擴(kuò)張型1例，低級(jí)別中心性 2例，骨旁骨肉瘤1例，骨膜骨肉瘤 1例)。Enneking GTM臨床分級(jí):Ⅱb期 46例，Ⅲ期 8例。HE切片由兩位資深病理學(xué)醫(yī)生診斷核實(shí)。部位:脛骨 21例，股骨 23例，肱骨上端 5例，髂骨、恥骨 3例，腓骨 2例。另取同期骨樣骨瘤 11例，骨母細(xì)胞瘤 7例，良性病變中的反應(yīng)性新生骨區(qū)域 8例。所有患者均先接受 4種藥物的新輔助化療，包括甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)8 g/m2(16 ～ 10 g)，阿 霉 素 (doxorubicin，ADM)30mg/m2連續(xù) 3 d，順鉑(cisplatin，CDP)100mg/m2，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide，IFO)3g/m2，連續(xù) 5 d。一般為 2～ 4個(gè)療程，每療程間隔 10～14 d，然后進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)通常為瘤段切除加假體置換術(shù)。術(shù)后根據(jù)術(shù)前新輔助化療療效，再常規(guī)進(jìn)行 8～12個(gè)療程的輔助化療。

1.2 試劑與方法 鼠抗人β-catenin單克隆抗體，超敏免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑等，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化 SP法，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) β-catenin:按照 Maruyama等[3]的方法分類，從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核三個(gè)方面判斷 β-catenin在細(xì)胞中的特征:70%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜表達(dá)陽性為正常表達(dá)，反之為表達(dá)缺失;細(xì)胞膜表達(dá)缺失或＞10%腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽性均為異常表達(dá);對(duì)異常表達(dá)情況再按著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行綜合評(píng)分，陽性比例 30%以下為 1分，30%～60%為2分，60%以上為 3分，著色程度:無著色為 0分(陰性)，淺黃色為 1分(弱陽性)，棕黃色為 2分(陽性)，棕褐色為 3分(強(qiáng)陽性)，然后根據(jù)兩者乘積的積分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，0～3分為弱陽性(+)，≥4分為陽性(++)。TCNR是目前國際公認(rèn)的從病理角度判斷化療效果較為精確的方法。具體計(jì)算參照夏賢良等[4]的方法。骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的診斷:術(shù)后每個(gè)月定期復(fù)查胸部 X線片，若 X線片可疑時(shí)立即 CT掃描。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher's精確概率法檢驗(yàn)，化療后 β-catenin蛋白表達(dá)變化等級(jí)資料兩樣本比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果 骨肉瘤 54例，隨訪時(shí)間:5～52個(gè)月，平均26.4個(gè)月。術(shù)后 2年內(nèi)肺轉(zhuǎn)移率 58.97%(23/39)，2年存活率為 52.17%(24/46)。其中 8例失訪，7例是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移不詳，未列入統(tǒng)計(jì)之列。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 β-catenin蛋白在大部分反應(yīng)性新生骨、骨樣骨瘤、骨母細(xì)胞瘤中正常表達(dá)，表現(xiàn)為沿胞膜分布棕黃色顆粒，而在骨肉瘤中易位至胞漿和(或)胞核，為異常表達(dá)(圖 1、2)。β-catenin蛋白異常表達(dá)率在反應(yīng)性新生骨、骨母細(xì)胞瘤、骨樣骨瘤及骨肉瘤中分別為 12.5%、28.57%、27.27%、66.67%。其中骨肉瘤組β-catenin蛋白異常表達(dá)率明顯高于骨樣骨瘤/骨母細(xì)胞瘤組和反應(yīng)性新生骨組(P＜0.01)。但 βcatenin蛋白陽性表達(dá)率在骨樣骨瘤/骨母細(xì)胞瘤組和反應(yīng)性新生骨組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 1。

表 1 β-catenin蛋白在新輔助化療前骨肉瘤、骨樣骨瘤、骨母細(xì)胞瘤以及反應(yīng)性新生骨中的表達(dá) 例

2.3 新輔助化療前β-catenin蛋白異常表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系 β-catenin蛋白異常表達(dá)率在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組明顯高于無肺轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。除此以外，二者與患者的年齡、性別、發(fā)病部位、病理類型、臨床分期、化療后 TCNR均無關(guān)(P＞0.05)。見表 2。

表 2 新輔助化前 β-catenin蛋白異常表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 新輔助化療后骨肉瘤組織中β-catenin蛋白表達(dá)的變化新輔助化療后 54例骨肉瘤中β-catenin蛋白由低表達(dá)或高表達(dá)轉(zhuǎn)為陰性表達(dá)的分別是10例和 11例;由高表達(dá)轉(zhuǎn)為低表達(dá)的有 9例;陽性表達(dá)程度不變的有 5例;另有 1例反而由低表達(dá)轉(zhuǎn)為高表達(dá)。新輔助化療前、后β-catenin蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表 3。新輔助化療后骨肉瘤中 β-catenin蛋白由高表達(dá)變?yōu)榈捅磉_(dá)或表達(dá)消失(圖 3)。但骨肉瘤化療前、后 β-catenin蛋白的表達(dá)與 TCNR未存在明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

圖 1 骨母細(xì)胞瘤中β-catenin蛋白胞膜表達(dá)(SP法×100)

圖2 化療前穿刺活檢骨肉瘤標(biāo)本β-catenin蛋 白胞 漿/核 表 達(dá)(SP法 ×100)

圖 3 新輔助化療后骨肉瘤組織 β-catenin蛋白陰性表達(dá)(SP法 ×100)

表 3 新輔助化療后骨肉瘤組織中 β-catenin蛋白表達(dá)的變化例

3 討論

β-catenin是 Wnt信號(hào)途徑中的一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在細(xì)胞中以兩種形式存在:(1)結(jié)合型，與上皮鈣黏附素(E-cadherin)結(jié)合于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，形成E-cadherin/catenin復(fù)合體，介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附;(2)游離型，參與 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過核膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與 DNA親和蛋白 LEF/TCF(lym phoid enhancer factor/T cell factor)結(jié)合，激活 Wnt途徑靶基因(如 C-myc、cyclinD 1、MMP-7、CD44、Claudin-1等)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色[5]。

本研究結(jié)果表明，從反應(yīng)性新生骨、骨樣骨瘤/骨母細(xì)胞瘤、骨肉瘤，β-catenin蛋白的異常表達(dá)率逐漸增高，且骨肉瘤中β-catenin蛋白的異常表達(dá)率明顯高于反應(yīng)性新生骨、骨樣骨瘤/骨母細(xì)胞瘤組。由此說明，β-catenin蛋白在骨肉瘤的發(fā)生中發(fā)揮了一定作用，檢測(cè) β-catenin蛋白對(duì)成骨性腫瘤良、惡性判斷有參考價(jià)值。從新輔助化療前 β-catenin蛋白的表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白異常表達(dá)與患者是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這與 Iwaya等[6]的研究結(jié)果一致。這說明 β-catenin蛋白與骨肉瘤的進(jìn)展有關(guān)，檢測(cè)β-catenin蛋白可預(yù)測(cè)患者是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，在一定程度上可判定患者預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)新輔助化療可降低β-catenin蛋白的異常表達(dá)，從而降低患者的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率，但β-catenin蛋白與TCNR未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性?；熆赡芡ㄟ^下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞β-catenin蛋白異常表達(dá)從而影響其生物學(xué)活性。對(duì)比檢測(cè)化療前、后β-catenin蛋白的表達(dá)，一定程度上可評(píng)價(jià)化療的療效，從而指導(dǎo)術(shù)后個(gè)性化化療。β-catenin的異常表達(dá)增強(qiáng)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制目前尚不完全明了。一方面，骨肉瘤中 β-catenin胞膜表達(dá)的消失可能降低了同種細(xì)胞間的黏附，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移。另一方面，Iwaya等[6，7]在 Dunncell(有高度轉(zhuǎn)移到肺潛能的鼠骨肉瘤細(xì)胞系)及骨肉瘤切除標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn) β-catenin外顯子的突變，說明其他調(diào)節(jié)機(jī)制在激活β-catenin通路中發(fā)揮作用。Arnsdorf等[8]認(rèn)為 N-cadherin介導(dǎo)的 β-catenin信號(hào)途徑在成骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重大作用。

β-catenin在骨肉瘤的異常表達(dá)可導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，因此β-catenin及其分子可能成為未來腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)。對(duì)其轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究可以進(jìn)一步有效地指導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的治療。

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