Cosmosil Cholester-HPLC法分離番茄紅素異構(gòu)體的研究

張連富, 張環(huán)偉

(1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫214122)

番茄紅素(Lycopene)是一種由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成的直鏈型多不飽和烯烴,分子式C40H56。由于番茄紅素分子中含有的雙鍵數(shù)目較多,分子不能內(nèi)旋轉(zhuǎn)、剛性較強,所以比較容易受光、熱、氧、酸等因素的影響而產(chǎn)生空間異構(gòu)體[1-2]。目前的研究發(fā)現(xiàn),食物中(如番茄醬中)天然存在的番茄紅素以全反式結(jié)構(gòu)為主(90%～98%),而人體的血清和腎上腺等組織中含有的番茄紅素主要是以順式結(jié)構(gòu)為主(79%～88%)——膳食與人體組織中番茄紅素空間構(gòu)型的差異性提示我們:順式結(jié)構(gòu)的番茄紅素可能更有利于被人體吸收,如果對含番茄紅素食物原料進行處理并提高其中順式結(jié)構(gòu)比例,就有可能提高產(chǎn)品的生物價并在此基礎上大幅提高其生物活性作用[3]。為了弄清上述問題,就必須獲得人體中常見番茄紅素空間異構(gòu)體的單體并進行體內(nèi)、體外試驗研究,而實現(xiàn)番茄紅素不同異構(gòu)體的分離是實現(xiàn)上述目標的首要前提。為此,作者本文即對 HPLC分離番茄紅素異構(gòu)體這種方法進行研究。

由于番茄紅素各異構(gòu)體間在極性、分子大小等方面差異很小(圖1),要實現(xiàn)他們之間的分離比較困難。目前國內(nèi)外普遍采用的分離方法是高效液相色譜法,主要有兩種方式:一種是采用C30柱來分離,但C30柱對分離不同類胡蘿卜素效果較好,對番茄紅素的順反異構(gòu)體的分離效果則不是很理想[4-6];另一種是Schierle J等建立的利用3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯(lián)用的方法對番茄紅素的異構(gòu)體進行分離,這種方法實現(xiàn)了順反異構(gòu)體的分離,但對順式異構(gòu)體間的分離效果也不十分理想。而且,3根色譜柱聯(lián)用在實際操作中也有很大的麻煩,需要長時間的平衡操作才能使色譜柱達到平衡狀態(tài)[7]。

鑒于目前所采用的色譜柱都存在一定的缺點,作者嘗試利用Cosmosil Cholester色譜柱來實現(xiàn)番茄紅素各異構(gòu)體之間的分離:Cosmosil Cholester柱是Nacalai Tesque Inc.開發(fā)的反相體系的HPLC柱,采用膽甾醇鍵合硅膠填料,具有與傳統(tǒng)的烷基鍵合C18、C30硅膠填料一樣的疏水性,因而其對功能基的選擇能力幾乎相同;但在分子形狀特別是空間立體異構(gòu)體的識別能力上Cholester柱的性能非常高。 等利用此種色譜柱對ceriporic acid異構(gòu)體進行了分離,取得了較好的分離效果[8]。考慮到ceriporic acid異構(gòu)體分離與番茄紅素空間異構(gòu)體的分離具有一定程度的相似性(圖2),作者對Cosmosil Cholester-HPLC體系分離番茄紅素空間異構(gòu)體進行了嘗試。

圖1 番茄紅素的幾種常見的順反異構(gòu)體Fig.1 Structure of the all-trans/cis-isomers of lycopene

圖2 Ceriporic acid結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structrure of Ceriporic acid isomers

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全反式番茄紅素(純度90%):華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。

乙腈:AP,上海凌峰化學試劑有限公司產(chǎn)品;四氫呋喃:AP,上海試四赫維化工有限公司產(chǎn)品;乙酸乙酯:AP,國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗儀器

UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計;高效液相色譜儀Ⅰ(P3000型高壓輸液泵,UV3000可變波長紫外/可見分光檢測器):北京創(chuàng)新通恒科技有限公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀 Ⅱ(Waters 2695型HPLC,Waters 996二極管陣列檢測器;Masslynx工作站);色譜柱:Cosmosil Cholester柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。

1.3 試驗方法

1.3.1 異構(gòu)化番茄紅素樣品的制備 參照Pierre Lambelet等[9]的方法進行順式化處理:稱取0.020 0 g的番茄紅素溶于100 mL乙酸乙酯中熱回流24 h。通過對反應前后的樣品進行全波長掃描,出現(xiàn)了文獻中報道的362 nm處的順式峰(圖3)。說明此樣品中已經(jīng)含有了順式異構(gòu)體,可以用于分離,摸索試驗條件。

圖3 反應前后的全波長掃描圖譜Fig.3 UV-Visible spectra of lycopene samples before and after isomerization

1.3.2 檢測方法 對反應前后的樣品進行全波長掃描,確定樣品中含有番茄紅素順式異構(gòu)體;用高效液相色譜儀Ⅰ對流動相比例、進樣量、流速等試驗條件進行優(yōu)化,將出峰個數(shù)、分離度R及峰形等3個指標作為分離效果的判斷標準,得出最佳分離條件;用高效液相色譜儀Ⅱ進行不同儀器間的重復性試驗。

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

綜合考慮各種試劑的性質(zhì)和對番茄紅素的溶解性性質(zhì),選取的試驗溶劑為四氫呋喃、乙酸乙酯與乙腈。選取的兩種流動相為:A)乙酸乙酯:乙腈,B)四氫呋喃(THF):乙腈。

從色譜圖中可以看出,兩種流動相在相同的配比條件下均對樣品中的物質(zhì)達到了分離的目的,分離出的峰的個數(shù)也相同。對各峰的分離程度和峰形等方面來看,結(jié)果也大致相同,采用流動相A的分離度(Rmin=1.7)要稍好于用流動相B(Rmin=1.3)。但是從保留時間來看,用A為流動相的保留時間(tR=68 min)明顯長于B(tR=42 min),這樣造成了分離成本的增加,所以試驗采用四氫呋喃和乙腈作為流動相。

圖4 不同流動相條件下分離樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase

2.2 流動相比例的確定

由上步選取流動相后,選擇不同比例的流動相來進行試驗,采取V(THF)∶V(乙腈)=25∶75、10∶90、5∶95 3個比例來進行試驗,試驗結(jié)果如圖5。

圖5 不同流動相比例下分離樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase ratio

由上圖可知,隨著流動相中極性物質(zhì)乙腈含量的增加,番茄紅素異構(gòu)體的分離效果越好。在V(THF)∶V(乙腈)=25∶75時,只分出了3個峰。當兩者的比例達到10∶90時,可以分出5個峰,分離效果較好。但是當兩者的比例達到5∶95時,分離效果與10∶90相似,但保留時間幾乎延長了一倍。流動相比例采用10:90的比例來進行試驗。

2.3 流動相流速的確定

流動相的流速對番茄紅素異構(gòu)體分離效果有一定的影響,根據(jù)本試驗所采用的儀器的性質(zhì)和承載能力,采用的流量為 1.4、1.0、0.6 mL/min 3個梯度。

流動相的流速對峰的分離效果的影響并不是十分明顯(圖6)。當流量低時,分離效果稍好,但保留時間太長,減短了儀器的使用壽命。當流量增大時,泵的壓力過大,對儀器的損害也是很大的。采用了比較常用的流量1 mL/min。

2.4 進樣量的確定

研究了進樣量對番茄紅素異構(gòu)體分離效果的影響,由于進樣閥的最大容積(20μL)的限制,所以采用的進樣量為20μL和10μL。

圖6 流動相不同流速分離樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of isomerized lycopene using different mobile phase flowrate

試驗結(jié)果表明(圖7),在進樣量為20μL時,分離度和10μL進樣的結(jié)果沒有大的區(qū)別。采用高效液相色譜儀Ⅱ檢測的30μL進樣,分離度小于20 μL進樣,由于樣品量太大,柱子的載量有一定的限度,流動相在沒有將前種物質(zhì)完全洗脫出來的時候,后種物質(zhì)已經(jīng)溶解于流動相中被洗脫出來,所以若進樣量過大,分離效果不是很好。采用的10 μL和20μL進樣對分離效果無明顯影響,則采用20μL的進樣量將有利于試驗效率的提高。

圖7 不同進樣量下分離樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of isomerized lycopene under different sample injection

2.5 重復性試驗

為了檢測試驗條件的可靠性,在以上試驗確定的試驗條件的基礎上,進行重復性試驗。圖8為高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖。同時,進行了不同儀器間的驗證性試驗,采用高效液相色譜儀Ⅱ?qū)悠愤M行重復性試驗,得到的試驗結(jié)果如圖9所示。

圖8 高效液相色譜儀Ⅰ分離的色譜圖Fig.8 Chromatogram of sample using HPLC I

圖9 高效液相色譜儀Ⅱ分離的色譜圖Fig.9 Chromatogram of sample using HPLC Ⅱ

從上面兩張色譜圖可以看出,作者所確定的試驗條件對樣品中的組分實現(xiàn)了分離。對分出的組分進行初步鑒定,從全波長掃描圖得出以上5個峰為同類型物質(zhì),可以認定為番茄紅素的異構(gòu)體。所以,此試驗條件可以用于番茄紅素異構(gòu)體的分離。與Pierre Lambelet等[9]所采用的3根正相柱聯(lián)用的方法相比,在對樣品進行了同樣的處理后進行分離,分離到了5個色譜峰,而且最小分離度也達到了1.3,基本可以將各個峰分開,并且此方法操作簡便,平衡時間短。而3根正相柱聯(lián)用的方法只分出了4個色譜峰,操作較復雜。所以本試驗基本達到預期效果。

在所確定的測定條件下,異構(gòu)化處理前番茄紅素樣品(全反式)的色譜圖及其中主要組分(全反式番茄紅素,響應時間為33.95 min)的UV-Vis光譜如圖10、11所示。對比處理后的色譜圖可知,所確定的番茄紅素異構(gòu)體分離條件適當,操作穩(wěn)定,重現(xiàn)性良好。

圖10 標準番茄紅素樣品的液相色譜圖Fig.10 Chromatogram of standard all-trans lycopene sample

圖11 標準番茄紅素樣品的 UV-Vis光譜圖Fig.11 UV-Visible spectra of satandard all-trans lycopene sample

3 結(jié) 語

通過對Cosmosil Cholester柱分離番茄紅素異構(gòu)體的條件進行優(yōu)化試驗,得到了一種可以較好分離番茄紅素異構(gòu)體的方法,并確定了分離條件為:流動相為V(四氫呋喃)∶V(乙腈)=10∶90,進樣量20μL,流量1 mL/min,檢測波長472 nm。并在此試驗條件下進行了重復性試驗,證明了此方法的重現(xiàn)性較好。與Schierle J等建立的3根Nucleosil 300-5正相色譜柱聯(lián)用法[7]相比,作者所使用的方法操作簡便,避免了由于3柱串聯(lián)所造成的漂移,易于實現(xiàn)色譜柱的平衡;與C30柱法[4-6]相比,本方法對各順式峰的分離效果更好些,分離效果基本達到完全分離要求。

[1]L Zechmeister,P Tuzson.Spontaneous isomerization of lycopene[J].Nature,1938,141(5):249-250.

[2]John shi,Yuzhu dai,Yukio kakuda,et al.Effect of heating and exposure to light on the stability of lycopene in tomato puree[J].Food Control,2008(19):514-520.

[3]Steven K Clinton,Curt Emenhiser,Steven J Schwartz,et al.Cis-trans lycopene isomers,carotenoids,and retinol in the human prostate[J].Cancer Epidemiology,1996(5):823-833.

[4]Curt Emenhiser,Lane C Sander,Steven J Schwartz.Capability of a polymeric C30stationary phase to resolve cis-trans carotenoid isomers in reversed-phase liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,1995(707):205-216.

[5]Jafar Muhammad EL-Qudah.Identification and quantification of major carotenoids in some vegetables[J].American Journal of Applied Sciences,2009,6(3):492-497.

[6]Volker Bonm,Ni Luh Puspitasari-Nienaber,Mario G Ferruzzi,et al.Trolox equicalent antioxidant capacity of different geometrical isomers ofα-carotene,β-carotene,lycopene,and zeaxanthin[J].Journal of Agricultural and Food Chenmistry,2002(50):221-226.

[7]Schierle J,Bretzel W,Buhler I,et al.Content and isomeric ratio of lycopene in food and human blood plasma[J].Food Chemistry,1997,59(3):459-465.

[8]Tsuzuki W,Ushida K.Preparative separation of cis-and trans-isomers of unsaturated fatty acid methyl esters contained in edible oils by RP-HPLC[J].Lipids,2009,44(4):373-379.

[9]Pierre Lambelet,Myriam Richelle,Karlheinz Bortlik,et al.Improving the stability of lycopene Z-isomers in isomerised tomato extracts[J].Food Chemistry,2009(112):156-161.